привет!

есть MS и MS-MS спектр некоего спота с 2D геля. Необходимо идентифицировать белок. Компутер ничего не находит, скорее всего потому как етот белок модифицирован двумя разными метками (чтобы функционально показать его уникальность).

Белок не абы какой а субъединица известного большого комплекса. То есть комплекс сначала чистили, потом метили и потмо делали 2D. Ничего "неизвестного" там буть не может. Выбрать надо из 5-10 кандидатов только.

Благодарность будет безмерной если кто мне подскажет как ето сделать. Тамошние специалисты разводят руками (Биоцентр, Франкфурт). Могу позвонить если надо.

спасибо.

А метки известны?

да, вот ета:
http://www.unimod.org/modifications_view.php?editid1=108

и ета
http://www.unimod.org/modifications_view.php?editid1=515

только пока пробема в том, что последняя скорее всего при обработке образцов и/или облучении дает некий не очень известный продукт, приделанный к белку, который картину усложняет.

А у меня нет доступа к юнимоду=( Если есть хотя бы одна метка, дающее стабильное производное и известны потенциальные места посадок... стоп, а сиквенс ведь есть? *с надежой* Потму как тогда вы отфильтровываете все немеченные пептиды и все пептиды с меткой 1. Оставшееся - метка 2. Но идентифицировать ее сложнее будет... Придется шаманить по близким массам.

там доступа не надо - кликайте на верхний баннер и попадаете в базу данных а там поиском ищите две модификации - NEM и FNEM.

гно задача не так проста - ето метки по цистеину - но неясно есть они или нет на данном конкретном фрагменте. но самое главное фрагментов мало и все явно модифицированные - не определяются. есть не только сиквенс, а просто надо выбрать из 8-10 кандидатов только.

Стоп. Я тогда что-то не догнал. Есть сиквенс. Щепите вы определенным методом, соответсвенно можете предсказать, какие массы пептидов можете получит в случае, если нет метки. Тогда, даже не зная, как именно рушится сама метка при взлете, вы можете прикинуть, какие именно пептиды у вас мечены. Кроме того, это вы можете оценить и заранее, если есть тот самый сиквенс. Или я не понимаю проблему.

нет, слегка не так - есть неизвестный спот с меткой полученый из 2D геля известного мультисубъединичного комплекса (всего в етом районе есть к примеру 10 кандидатов). вырезаем, трипсинизируем - MS-MS (оговорюсь сразу что делаю не я) - полученые фрагменты не подходят ни к какой субъединице, потмоу что метка(и) висящая на цистеине не 427, как у FNEM, а другой массы.

плюс еще скорее всего помечены NEM и другие цистеины в етой субъединице.

в общем как всегда нужнго было чтобы делом занялся человек, который соображает в том что он делает.

субъединицу определили с помощью протеолиза разными ферментами - так как она оказалась сильно гидрофобная и маленькая, то генерируется очень мало фрагментов, а летит всего один более менее длинный гидрофильный фрагмент который между трансмембранными спиралями. все остальные фрагменты меньше 500 Да или больше 4000. удалось получить даже MS/MS - так что почти 100% гарантия.

Fluoresceine-NEM не разваливается лазером, как ни странно. хотя окисляется метионин.

в общем может кому-нибудь поможет.