Привет!

Если кто-то делал Gateway колонирование раньше, то знает, что компания Invitrogen предлагает при клонировании создавать праймера так, что бы AAAAAA сиквенс в праймерах с attB1 был бы в рамке с колнируемым сиквинцем, т.е. с ATG. Вопрос такой, если клонируется ORF то тогда это может быть важно, елси будущий вектор будет использоваться для экспрессии фьюжина (если там His, FLAG, GFP и прочее), но вот если мне надо склонировать полный сиквенс включая 5'UTR, то надо ли следовать этому правило. Ведь фактическия тогда мы не можем исльзованить никакие таги и значит этот вектор не будет использовать для этих целей. Наша цель только сделать оверэкспрессию белка, как можно болльше приблизив её к нативной стадии в клетках. Значит ли это, что в этом случае мы можем уже не обращать внимание на "рамку", так как 5'-нетранлируемый участок не должне повлиять на нашу экспрессию и всё равно белок будет экспрессироваться нормально. Или лучше всё же высчитать рамку так, что бы даже несмотря на длинный (почти 500 bp) нетранслируемый участок, праймеры attB1 всё равно бы совпадали с рамкой ATG нашего белка?

Это не только и не столько вопрос из области gateway клонирования, сколько из области "клеточной механики" и белкового синтеза.

спасибо.

не нужна вам рамка.

Но с другой стороны если нам ничего не стоит сохранить рамку, просто перевдинув праймеры так, что бы рамка была, то тогда это же не помешает её сохранить? Так ли?

сколько у вас стоп-кодонов в этом длинном, почти 500 бп нетранслируемом участке в рамке считывания?

7 стоп кодонов если рамка правильная и последний стоп-кодон находится на расстоянии 52 нуклеотидов от M.

8 и 5 стоп-кодонов для двух других рамок и их последний стоп находится на большем растоянии от M.

Напишите, какова у Вас логика рассуждений? Может ли этот 500 bp участок кодировать какие-то miRNA или shRNA? Может ли там быть какой-то регуляторный участок на уровне РНК? Скажем как это РНК будет подвергаться сплайсингу, или как будет деградироваться на выходе из ядра и так далее. Где можно посмотреть такую информацию для известных сигнальных-сиквенцев?

Всего у этого гена 7 транскриптов. И два некодирующих транскрипта, которые не содержат ORF; один хоть и содержит, но деградируется по Nonsense mediated decay. И только 4 производят белок (у всех разное число экзонов и разная длина некодируемого участка).