В рамках данной системы энзиматический каскад, включающий ферменты Е1, E2 и убиквитинлигазу Е3, катализирует присоединение к белкам, подлежащим деградации, полиубиквитиновой цепи определенной структуры. Эта цепь затем узнается протеасомой, которая непосредственно осуществляет деградацию белка-мишени. Воздействуя на данный процесс, теоретически возможно направить на путь деградации отдельные выбранные белки. Так, некоторые вирусы используют различные механизмы для изменения активности УПС в поражаемых клетках в своих целях. Попытки использовать УПС для селективного нокаута белков предпринимались и различными исследовательскими группами, однако до настоящего времени было опубликовано лишь несколько примеров такого подхода, в силу разных причин применимых лишь к небольшому числу белков.
В опубликованной в Journal of Biological Chemistry статье группа исследователей из университета Корнелла под руководством Matthew DeLisa представила оригинальный метод, который претендует на универсальность и может использоваться для элиминации практически любых внутриклеточных белков. Метод основан на «перепрограммировании» УПС с использованием химерных ферментов, осуществляющих убиквитилирование выбранных белков и их направление на путь протеасомной деградации.
Модульно-иерархический принцип организации каскада убиквитилирования позволил достигнуть цели с помощью модификации лишь 1 компонента системы – убиквитинлигазы E3. Основой послужила убиквитинлигаза CHIP. Этот фермент довольно хорошо охарактеризован и отвечает за убиквитилирование большого числа внутриклеточных белков, распознавание которых происходит с участием домена TPR. В описываемом эксперименте этот домен был удален и заменен искусственными конструкциями, которые авторы называют «дизайнерскими связывающими белками» (designer binding proteins, DBP). В качестве таких распознающих белок-субстрат модулей использовались одноцепочечные Fv-фрагменты антител, или Fv-интратела (
По аналогии с антителами, авторы называют созданные ими химерные белковые конструкции «убиквителами» (ubiquibodies). Для проверки работоспособности метода использовались химеры, включающие интратела к бета-галактозидазе и монотела к мальтоза-связывающему белку MBP. В экспериментах in vivo с использованием котрансфекции белков-мишеней и специфичных к ним убиквител в 3 клеточных линиях авторам удалось продемонстрировать эффективный нокаут выбранных белков. При этом уровень эндогенных субстратов убиквитинлигазы CHIP дикого типа оставался неизменным. Масс-спектрометрические исследования подтвердили, что убиквитела катализировали присоединение к белкам-мишеням именно того типа полиубиквитиновых цепей, который помечает внутриклеточные белки для протеасомной деградации. При этом степень элиминации белка-мишени напрямую зависела от концентрации плазмид, кодирующих убиквитела.
Использование предлагаемого метода поможет существенно упростить исследования эффектов полной или частичной элиминации того или иного белка в клетке. Кроме того, данная технология имеет большой потенциал для разработки новых терапевтических подходов, основанных на селективной элиминации аберрантных белков, например, в случае некоторых видов рака и нейродегенеративных заболеваний.
авторский текст
Источник: Portnoff AD, Stephens EA, Varner JD, Delisa MP.
Подпись к рисунку: Схема работы УПС в естественных (слева) и в модифицированных (справа) условиях. В первом случае ферменты Е1, Е2 и Е3 катализируют присоединение убиквитина к нативным субстратам (S), которые затем подвергаются деградации в протеасоме. Во втором случае химерный фермент Е3-DBP убиквитилирует заданный белок-мишень (T).
Рисунок из обсуждаемой статьи.