Einkomponentige Lösungen

Über das nochmalige Berechnen von Rezepten für das gewünschte Volumen:

Organische Substanzen

Temperaturabhängigkeit des pH bei gewöhnlichen Puffern

Puffer: pKa/20oC delta pKa/10oC MES 6.15 -0.110 ADA 6.60 -0.110 PIPES 6.80 -0.085 ACES 6.90 -0.200 BES 7.15 -0.160 MOPS 7.20 -0.013 TES 7.50 -0.200 HEPES 7.55 -0.140 Tricine 8.15 -0.210 Tris 8.30 -0.310 Bicine 8.35 -0.180 Glycylglycine 8.40 -0.280

ATP

C₁₀H₁₄N₅O₁₃P₃Na₂ Mw=551.1 g/M; (lagern bei -20^oC).

Konz. Stamm. 1ml ATP 0.1M 551.1g/M 55.1mg H2O   mQ

0.1M ATP (pH 7.2): 5.71% (w/w) ATP, 84.86% (w/w) H₂O, 9.43% (w/w) 2M Tris base.

Einstellen auf pH 7.5 mit 2 M NaOH (~70-80µl);

setzen Sie ungefähr 700µl an, verdünnen Sie um das 2000-fache (das ist die Endverdünnung in der spektrophotometrischen Zelle), prüfen Sie die OD (optische Dichte):

c[M]=A₂₅₉/15.4x10³=A_{259 1:2000}x0.130; füllen Sie dann auf das Endvolumen auf.

Betaine

monohydrate C₅H₁₁NO₂xH₂O; Mw=135.2g/M; (lagern bei 4^oC).

Konz. Stamm. %(w/w) 100ml 200ml 700ml Betaine 135.2g/M 5M 63.00 67.6g 135.2g 473.2g H2O   mQ 37.00 39.74ml 79.49ml 278.2ml

p~1.073g/ml

Cresol red (Na)

50mM (lagern bei +4, -20^oC):

Konz. Stamm. 1ml 50ml cresol red (Na) 50mM 404.4g/M 20.2mg 1.01g H2O   mQ

Cresol Red (Na salt) is a very convenient dye. At a concentration of about 0.2mM it is compatible with restriction digestion, PCR, sequencing. It may be used as marker for electrophoresis.

Die Farbe des Farbstoffes ist pH abhängig (rot, falls pH > 7,5; gelb, falls pH < 7,5). Es ist möglich Kresol Rot als pH-Indikator zu verwenden (i) beim Denaturieren von doppelsträngiger DNS beim Sequenzieren, (ii) bei der Silica-Aufreinigung von DNS von Agarosegel.

DTT

C₄H₁₀O₂S₂ Mw=154.2g/M; (lagern bei -20^oC).

Konz. Stamm. %(w/w) 1ml 5ml 10ml 20ml DTT 154.2g/M 1M 14.55 0.155g 0.773g 1.55g 3.09g H2O   mQ 85.45 905 µl 4.53ml 9.05ml 18ml

p~1.06g/ml

Konz. Stamm. 1ml 5ml 10ml 20ml DTT 154.2g/M 2.2M 0.339g 1.696g 3.394g 6.787g H2O   mQ

steril Filtrieren;

keine Behandlung mit DEPC;

Wir wissen zwar nicht weshalb, jedoch wird in vielen Anleitungen (vielleicht nach "Maniatis") empfohlen es in 10 mM NaAc, pH 5.2, anzusetzen.

Ansetzen von dNTP’s

Das knappe Protokoll für ~100 mM Stammlösung.

1. Verdünnen Sie alle vier dNTPs (je 250 mg) in 3.676 ml H₂O;
2. + 424µl 5M NaOH;
3. Prüfen Sie den pH: ~0.5µl auf pH-Indikatorpapier.




Ausführliches Protokoll zum Ansatz von 100 mM Stammlösung.

1. Geben Sie die benötigte Menge (s. Tabelle) an H₂O und Tris-Base 1 M hinzu (es kann ein Salzvolumen von ~150µl verwendet werden);

Mw V(H2O) V(Tris base 1M) V(final) dATP C10H14N5O12P3Na2x3H2O 589.2 3.24ml 850 µl 4.24ml dGTP C10H13N5O13P3Na3x2H2O 609.2 3.55ml 400 µl 4.10ml dCTP C9H13N3O13P3Na3x2H2O 569.1 3.44ml 800 µl 4.39ml dTTP C10H14N2O14P3Na3x2H2O 584.1 3.73ml 400 µl 4.28ml

2. Prüfen Sie den pH: ~0.5µl auf pH-Indikatorpapier;
3. Prüfen Sie die Qualität und Konzentration (Es ist hilfreich eine Endverdünnung con 1:5000 (~20µM) zu wählen. In diesem Fall wird die optische Dichte im Bereich von Am~0.3 liegen – dem genauesten Bereich für Spektrophotometer).
   Die Konzentration beträgt c[mM]=k_1:5000xA_m.

Qualität:

dATP pH 7.0 A250/A260=0.80+0.03 A280/A260=0.12+0.02 dCTP pH 2.0(!) A250/A260=0.45+0.03 A280/A260=2.10+0.15 A290/A260=1.60+0.10 dGTP pH 7.5 A250/A260=1.18+0.04 A280/A260=0.67+0.03 A290/A260=0.28+0.03 dTTP pH 7.5 A250/A260=0.65+0.03 A280/A260=0.73+0.03

Konzentration:

Mw Am pH E k (for 1:5000) dATP[Na2] 589.2 259 7.0 15.2x103 328.9 dGTP[Na3] 609.2 253 7.5 13.7x103 365.0 dCTP[Na3] 569.1 280 2.0 (!!!) 13.0x103 384.6 dTTP[Na3] 584.1 267 7.5 9.6x103 520.8             ATP [Na4] 595.1 259   15.4x103   CTP [Na4] 571.1 280   13.0x103   GTP [Na4] 611.1 252   13.7x103   UTP [Na4] 572.1 262   10.2x103

Konzentration: c[M]=A_max/E; A_max = Absorptionsmaximum.

EDTA

C₁₀H₁₄O₈N₂Na₂x2H₂O; Mw=372.3g/M; pH = 8.0 (lagern bei 4^oC).

Konz. Stamm. %(w/w) 50 ml 100 ml 150 ml 250 ml EDTA 0.5 M 372.3g/M 16.98 9.31g 18.62g 27.92g 46.55g NaOH ~0.5 M 40g/M 1.82 1.014g 2.028g 3.042g 5.07g H2O   mQ 81.19 44.48ml 88.95ml 133.4ml 222.4ml

Konz. Stamm. 10 ml 50 ml 100 ml 150 ml 250 ml EDTA 0.5 M 372.3g/M 1.86g 9.31g 18.62g 27.92g 46.55g NaOH ~0.5 M 10M 507µl 0.674g 2.535ml 3.37g 5.07ml 6.74g 7.61ml 10.11g 12.68ml 16.85g H2O   mQ 8.42ml 42.12ml 84.24ml 126.4ml 210.6ml

p~1.096g/ml

EDTA ist bei saurem pH nicht löslich. Es ist notwendig graduell Lauge hinzuzugeben und den pH zu kontrollieren.

Nicht mit DEPC behandeln.

EtBr

Ethidium bromide, C₂₁H₂₀N₃Br; Mw=394.3g/M; (lagern bei NT in the dark);

Konz. 5ml 10ml 50ml EtBr 10mg/ml 50mg 100mg 500mg

Löslich in H₂O, EtOH, Chloroform;

Die karzinogenen Eigenschaften von EtBr betreffend. Die einzigen Informationen die wir in der Literatur gefunden haben, sind, daß in mutagenen Tests mit Bakterien 90µg EtBr den gleichen Effekt hatten wie der konzentrierte Rauch einer Zigarette.

Gelatin

(lagern bei 4^oC).

Konz. Stamm. 10ml 50ml 100ml Gelatin 2% fest 0.2g 1.0g 2.0g H2O   mQ

Autoklavieren.

Glucose

C₆H₁₂O₆xH₂O, Mw=198.17g/M; 39.6%, p=1.13

Konz. Stamm. %(w/w) 200ml 500ml Glucose 2M 198.17g/M 35.07 79.27g 198.2g H2O   mQ 64.93 146.6g 366.5g

Guanidine HCl

CH₅N₃xHCl, Mw=95.53g/M

Molarität   1 2 3 4 5 6 Guanidine HCl (g/L) 95.53g/M 95.53 191.06 286.59 382.12 477.65 573.18 H2O (ml/L) mQ 924.2 854 783.7 711.7 639.8 567.2 Guanidine Cl %(w/w)   9.37 18.28 26.78 34.93 42.75 50.26 H2O %(w/w)   90.63 81.72 73.22 65.07 57.25 49.74 p (g/ml)   1.020 1.045 1.070 1.094 1.117 1.140

Löslichkeit: bei 25^oC -> 8.54M, 5^oC->>8M;

A₂₆₀(6M in H₂O)<0.03;

es ist möglich in Berechnungen von Lösungen 0.763 als "Partialdichte von Guanidin HCl" zu verwenden.

HEPES

Konz. Stamm. %(w/w) 1L C8H18N2O4S 1M 238.3g/M 22.40 238.3g H2O   mQ 77.60 825.7ml

p=1.064

HEPES, 1M, 1L

KOH, 5M [ml] pH 0 5.25 0.5 5.35 3.5 5.75 7 6.03 12 6.24 22 6.59 32 6.71 45 6.88 50 7.00 60 7.10 80 7.25 92.5 7.37

Imidazol

C₃H₄N₂, (lagern bei 4^oC):

Konz. Stamm. 50ml 100ml Imidazole 2M 68.1g/M 6.81g 13.62g H2O   mQ

Paraformaldehyde

PFA (paraformaldehyde) 37% (für Histochemie sollte sie frisch angesetzt werden.

1. im Schraubdeckelröhrchen mischen:

PFA (fest) => 0.37g,
H₂O => 1.0ml
NaOH (1N) => 14µl;

2. im heißen Wasserbad lösen (erhitzen bis der pH auf ~7.0 =>~1-3') fällt.

PEG

H(OCH₂CH₂)_nOH; (lagern bei 4^oC).

Konz. %(w/w) 10ml 50ml 100ml 150ml 200ml PEG6000 40% 37.21 4.0g 20g 40g 60g 80g H2O mQ 62.79 6.75g 33.75g 67.5g 101.25g 135.0g

p=1.075.

PMSF

(lagern bei -20^oC)

Konz. Stamm. 20ml C7H7FO2S 100mM 174.2g/M 0.348g Isopropanol     20ml

Retinoic acid

(all trans-R.a., Tretinoin, light-sensitive, lagern bei -20^oC):

Konz. Stamm. 16.6ml C20H28O2 10mM 300.4g/M 50mg EtOH   >96% 16.6ml

Die Molarität der Stammlösung beträgt 10mM, die Molarität der frisch mit EtOH angesetzten gebrauchsfertigen Lösung beträgt 1mM (es ist ratsam reines EtOH zu den Kontrollzellen hinzuzugeben).

Tris Cl

C₄H₁₁O₃N; Mw=121.1g/M; (lagern bei 4^oC).

Konz. Stamm. 50 ml 100 ml 150ml 200ml Tris-base 1M 121.1g/M 6.06 12.11g 18.17g 24.22g H2O zum Gesamtgewicht   mQ 52.03g 104.06g 156.09g 208.12g

1M: p=1.0406

2M Tris base: 22.90%(w/w) Tris base, 77.10%(w/w) H₂O; p=1.058

nicht mit DEPC behandeln;

Autoklavieren;

Der pH von Tris-Puffern ist von der Konzentration abhängig. Wenn Sie als Original die 50mM Lösung benutzen:

pH(500mM) => + 0.05
pH(5mM) => - 0.05

Der pH fällt um 0.028, wenn die Temperatur um 1^oC steigt.

Die Temperaturabhängigkeit des pH für 50 mM Tris Cl

pH bei g/Liter für 0.05 M 5°C 25°C 37°C Tris HCl Tris Base 7.55 7.00 6.70 7.28 0.47 7.66 7.10 6.80 7.13 0.57 7.76 7.20 6.91 7.02 0.67 7.89 7.30 7.02 6.85 0.80 7.97 7.40 7.12 6.61 0.97 8.07 7.50 7.22 6.35 1.18 8.18 7.60 7.30 6.06 1.39 8.26 7.70 7.40 5.72 1.66 8.37 7.80 7.52 5.32 1.97 8.48 7.90 7.62 4.88 2.30 8.58 8.00 7.71 4.44 2.65 8.68 8.10 7.80 4.02 2.97 8.78 8.20 7.91 3.54 3.34 8.88 8.30 8.01 3.07 3.70 8.98 8.40 8.10 2.64 4.03 9.09 8.50 8.22 2.21 4.36 9.18 8.60 8.31 1.83 4.65 9.28 8.70 8.42 1.50 4.90 9.36 8.80 8.51 1.23 5.13 9.47 8.90 8.62 0.96 5.32 9.56 9.00 8.70 0.76 5.47 9.67 9.10 8.79 0.69 5.53




TrisCl: 250ml 1M

V HCl V HCl pH   0 10.44   1 9.54   2 9.26   3 9.08   3.7 8.98 5ml   8.76 6ml   8.67   10 8.4 11ml   8.22   14 8.13 13.5ml   8.06 14ml   8.04 15ml   7.97   17 7.92 16.5ml   7.82 16.7ml   7.8 17ml   7.77 18.3ml   7.63 18.6ml   7.59   20 7.75   23 7.4




1M Tris HCl:

pH Trizma base %(w/w) Trizma HCl %(w/w) H2O %(w/w) 7.5 2.30 12.37 85.33 8.0 5.16 8.64 86.20 8.2 6.50 6.89 86.61 8.8 9.63 2.82 87.55 9.5 10.76 1.02 88.22

Tricine

C₆H₁₃NO₅, Mw=179.2g/M;(lagern bei 4^oC).

Konz. Stamm. 50ml Tricine 1M 179.2g/M 8.96g H2O   mQ

For 50ml:

5N KOH pH 7.0ml 8.30 7.5ml 8.38 8.0ml 8.47 8.15ml 8.5 8.5ml 8.6 9.0ml 8.68 9.5ml 8.78 10.0 8.90

Triethanolamine

1M (lagern bei 4^oC):

Konz. Stamm. %(w/w) 50ml Triethanolamine 1M 149.19g/M 14.69 7.46g 6.66ml H2O   mQ 85.31 43.34ml

Urea

CH₄N₂O, Mw=60.06g/M;

Molarity   1 2 3 4 5 6 7 8 CH4N2O(g/L) 60.06g/M 60.06 120.12 180.18 240.24 300.30 360.36 420.42 480.48 H2O (ml/L) mQ 950.6 905.8 861.3 817.0 771.6 726.7 681.2 635.7 p (g/ml)   1.011 1.026 1.041 1.057 1.072 1.087 1.102 1.116 CH4N2O %(w/w)   5.94 11.71 17.30 22.72 28.02 33.15 38.16 43.05 H2O%(w/w)   94.06 88.29 82.70 77.28 71.98 66.85 61.84 59.95

Löslichkeit: bei 25^oC: 10.49M, 5^oC: ~8M;

A₂₆₀(6M in H₂O)<0.06;

es ist möglich in Berechnungen von Lösungen 0.763 als "Partialdichte von Urea" zu verwenden.

Säuren und Laugen

Name: Formel: Mw % (w/w) [M] g in 1L Substanz. p [g/ml] ml/L für 1M Lösung Sodium hydroxide NaOH 40 50% 19.1 763 1.53 52.4 30.1% 10.0 400 1.329 100 Potassium hydroxide KOH 56.1 50% 13.5 757 1.52 74.1 23.06% 5.0 280.6 1.217 200 Ammonium hydroxide NH4OH 35.0 28% 14.8 251 0.89 67.6 Acetic acid, glacial CH3COOH 60.1 99.5% 17.4 1045 1.05 57.5 Acetic acid 36% 6.27 376 1.05 159.5 Formic acid HCOOH 46.0 90% 23.4 1080 1.20 42.7 Hydrochloric acid HCl 36.5 36% 11.6 424 1.18 86.2 Nitric acid HNO3 63.0 71% 15.99 1008 1.42 62.5 Perchloric acid HClO4 100.5 70% 11.65 1172 1.67 85.8 Phosphoric acid H3PO4 98.0 85% 18.1 1445 1.71 55.2 Sulfuric acid H2SO4 89.1 96% 18.0 1766 1.84 55.6

NaOH

Mw=40g/M; (lagern bei NT).

Konz. Stamm. %(w/w) 50ml 200ml 300ml NaOH 10M 40g/M 69.90 20g 80g 120g H2O   mQ 30.1 46.45ml 185.8ml 278.7ml

10M: 30.10%; p=1.329.

Konz. Stamm. 50ml 150ml 200ml NaOH 1M 10M 5ml 6.645g 15ml 19.94g 20ml 26.58g H2O   mQ 45ml 135ml 180ml

es ist besser Plastikflaschen zur Lagerung zu verwenden, da die Lauge das Glas leicht anlöst.

KOH

Mw=56.11g/M; (lagern bei NT).

Konz. Stamm. %(w/w) 10ml 50ml 100ml 150ml KOH 5M 56.11g/M 23.05 2.806g 14.03g 28.06g 42.08g H2O   mQ 76.95 9.363g 46.81g 93.63g 140.4g

5M: 23.06%; p=1.217.

es ist besser Plastikflaschen zur Lagerung zu verwenden, da die Lauge das Glas leicht anlöst.

Trichloroacelic acid

Trichloroacelic acid,CCl₃CO₂H Mw=163.39, (bei NT, im Dunkeln, unter dem Abzug lagern.

Konz. %(w/w) 5ml 10ml 25ml 50ml TXÓ 100% (w/v) 68.78 5.0g 10.0g 25.0g 50.0g H2O mQ 31.22 2.27ml 4.54ml 11.35ml 22.7ml

Detergenzien

N-Lauroylsarcosine Na

(lagern bei NT).

Konz. Stamm. 1ml 3ml 5ml 15ml 50ml Sarc 10% 30% 0.333ml 0.342g 1.00ml 1.027g 1.67ml 1.712g 5.00ml 5.14g 16.67ml 17.12g H2O   mQ 0.667ml 2.00ml 3.33ml 10.00ml 33.33ml

p=1.017.

SDS

Sodium dodecyl sulfate, sodium lauryl sulfate; [CH₃(CH₂)₁₀CH₂SO₄]Na; Mw=288.4g/M; (lagern bei NT).

Konz. Stamm. %(w/w) 100 ml 250 ml 300 ml 400 ml SDS 10%(w/v) fest 9.82 10g 25g 30g 40g H2O   mQ 90.18 91.8 ml 229.5 ml 275.4 ml 367.2 ml

p = 1.018

unter dem Abzug wiegen (und sicherheitshalber eine Atemschutzmaske tragen);

es muß auf 60-80^oC erhitzt werden, um den Lösungsvorgang zu beschleunigen. pH prüfen. Wenn dieser vom Neutralwert (~7.2-7.5) stark abweicht, mit verdünnter Lauge/ Säure einstellen.

Organische Lösungsmittel

Phenol

C₆H₅OH; Mw=94.1g/M
p=1.054, t_m= 43, t_b= 182, pKa=10.0
Löslichkeit: 6.8¹⁶H₂O, unbegrenzt ⁶⁶H₂O; unbegrenzt EtOH

Ansetzen von "saurem" und "neutralem" Phenol.

a) aus der Destillation:

1. Phenol destillieren, so daß es unter das H₂O sinkt;
2. Volumen des Wassers auf ca. 1/10 der Phenolphase einstellen;
3. 8-Hydroxyquinolin zu 0.1% (relativ zur Phenolphase) und ßMeEtOH (2-Mercaptoethanol) zu 0.2% (relativ zum H₂O = 0.02% bezogen auf die Phenolphase) hinzugeben;

---- mit diesem Schritt haben Sie das "saure Phenol" gewonnen. Bei –20^oC lagern (~1 Jahr); ----

4. geben Sie ungefähr das gleiche Volumen an 0.2 M Tris-Base zum Phenol, ~0.5-1 Std. mischen;
5. verwerfen Sie die wässrige Phase;
6. + 0.1V 0.1M Tris-Cl, pH 8.0
7. 0.2% bMeEtOH
8. ~0.5-1 Std. mischen;
9. ~einige Monate bei 4^oC (im Dunkeln) lagern.

b)aus der kommerziellen Substanz:

1. Phenol mit Wasser sättigen (ca. 1/5 V hinzufügen);
2. dann, (a) entsprechend, weiter ab dem Punkt 2.

______________
* Zur RNS Extraktion ist es besser das "saure Phenol" mit dem folgenden Puffer zu sättigen (einfach hinzugeben): (bei 4^oC lagern):

Konz. Stamm. 100ml AcONa, pH 5.1 50mM 3M 1.67ml EDTA 10mM 0.5M 2.0ml H2O   mQ 96.0ml

Prüfen Sie den pH-Wert und stellen Sie diesen bei Bedarf mit verdünnter (1:100) Essigsäure ein.

in den "Mitchell Group Methods" gab es einen Hinweis darauf, daß saures Phenol viel stabiler ist als neutrales. Sie empfehlen neutrales Phenol nur in kleinen Mengen herzustellen und nur einige Wochen zu lagern.

EtOH

CH₃CH₂OH; Mw=46.1g/M;

p (w/w) % (v/v) %   p (w/w) % (v/v) %   p (w/w) % (v/v) % 0.7892 100.00     0.83 85.4     0.89 60.5   0.79 99.7     0.84 81.4     0.90 56.12   0.80 96.5     0.85 77.3     0.91 51.71   0.8042 95.00 96.80   0.86 73.2     0.92 47.2   0.81 92.9     0.8678 70.02 76.96   0.93 42.50   0.8114 92.42 95.01   0.87 69.0     0.94 37.6   0.8178 90.05 93.31   0.88 64.8           0.82 89.2     0.8855 62.40 70.01

sehr hygroskopisch, (bei NT in dicht verschlossenem Gefäß lagern); t_melt.=-117.3^oC; t_boil.=78.5^oC.




Konz. Stamm. 300ml EtOH 70% 96% 190g H2O   mQ 70ml

Ansetzen von 100% EtOH

1. trocknen Sie CuSO₄ (bei 65^oC, 1-2 Tage) bis zum Erreichen der so gut wie weißen Farbe;
2. mischen Sie ca. 1/4 Volumenanteil des CuSO4₄ mit 3/4 Volumenanteil des 96% EtOH;
3. intensiv mischen;
4. 1-2 Tage stehen lassen (CuSO4₄ entzieht dem Ethanol das Wasser).

Prüfen Sie das "100%" Ethanol: geben Sie einen Tropfen Ethanol zum Xylen. Im Falle von 100% Ethanol darf sich kein Nebel bilden.

"Praktische Molekularbiologie" http://www.molbiol.ru/ger
e-mail: editor@molbiol.ru