Новый протокол "Сбор полевого материала для ПЦР" /Владимир А. Чистяков; Ростов-на-Дону/. После фиксации ДНК нормально выделяется как фенол/хлороформным методом, так и солевой экстракцией. Текст подготовлен по материалам обсуждения на Форуме.

Дополнение к протоколу "Выделение геномной ДНК из растений" от Елены Ким (kimuch_xx1@mail.ru), магистрантки каф. Цитологии и гистологии СПбГУ. В колонку новостей вынесено из-за того, что я о таком фокусе слышу в первый раз.

В разделе "Справочник" появился ещё один вариант таблицы генетического кода. На этот раз в таблица упорядочена по аминокислотам, а напротив них перечислены соответствующие кодоны. Иногда так удобнее (например, когда разбираешься с незначащими заменами при мутагенезе).

Открыта давно обещанная "Весёлая страничка". Идея была предложенна zelensky:

При переносе сообщений с соответствующих страниц форума поправлены опечатки, выброшены диалоги "не в тему" и небольшая часть шуток (те, которые мы не поняли). Организованы ссылки на три "весёлых страницы" форума. Первые две - старые, последняя новая. Новая страница организована потому, что на старых уже 4 и 7 листов - читать стало неудобно.

Новый протокол: "Осаждение белков сульфатом аммония". Самое интересное - в комментариях: влияние на растворимость белков ионной силы, pH, температуры; почему применяется именно сульфат аммония и т.п.

Дополнение не в тему, а как иллюстрация предложения. Может быть, стоит организовать на Вашем сайте раздел про разные ферменты. Думаю, многие согласятся, что в каталогах часто указывают не все илм не совсем как есть, поэтому перед использованием некоторые качества ферментов приходится проверять. Иногда всякие приколы выясняются. Такие мелочи не опубликуешь, зато кому-то может пригодится, на те же грабли не наступят.

Возился на днях с Uracil DNA Glycosylase (UDG). Этот фермент вырезает уридины из ДНК, образуя abasic сайты, которые рушатся при нагревании. Сначала проверил, как она щепит праймер с двумя U в середине. Получил вот такую картинку: сначала идут двукратные разведения UDG (Sigma #U1257) начиная с 0.5u на дорожку, на последней дорожке исходный праймер. На реакцию (10µl) брал 5pmol меченого праймера. Условия: 37^oC - 15', 95^oC - 15'. Выходит, что UDG работает при совсем небольших концентрациях, а еще, видимо, в праймер при синтезе вставляют смесь U c T, так как на всех дорожках что-то остается.

Потом, для работы мне нужно было знать, когда начинают валится abasic сайты, поэтому после обработки UDG я держал реакцию на 95^oC от 1 до 20 минут. Тоже есть на что посмотреть.

Я могу еще что-нибудь прислать, уверен, что у большинства посетителей форума полно всяких таких интересных мелочей в рабочих тетрадях.

В разделе "Методы/Выделение pDNA" появился новый протокол: "Выделение плазмидной ДНК на силикагеле" /Вячеслав Юрченко, Екатерина Мерзляк. Описана homemade копия Wizard Minipreps ДНК Purification System (Promega). Прислал Вячеслав Юрченко (vyurchen@aecom.yu.edu). Автору - огромное спасибо, всем остальным - удачного применения.

Обычно о появлении дополнений к протоколам не сообщается в колонке новостей сайта. Но это случай особый и, надеюсь, многим интересный. Пришло вот такое сообщение: Дополнение к 17_08 Western блоттинг

Новый протокол: "Получение серийных делеций инсерцией гена устойчивости к антибиотику". Метод больше всего напоминает in vitro инсерционный мутагенез в системах на основе транспозона Tn5, Tn7 или Mu. Главное достоинство - просто и дёшево.

Анча Баранова из ИОГЕН РАН прислала протокол очистки центрифугированием ДНК из агарозного геля.

В разделе "Методы" выложен ещё один протокол, посвящённый выделению плазмид: "Амплификация и выделение низкокопийных плазмид" от Татьяны Веремейко (veremeiko@ngs.ru). Кроме того, она прислала существенное дополнение к протоколу "Электропорация", касающееся приготовления электрокомпетентных клеток без заморозки.

Новый протокол "Окрашивание белковых гелей Coomassie brilliant blue G-250" от Инны Кригер (kriginkri@mail.ru). Это модифицированный метод из статьи Reisner A.H., Nemes P., Bucholtz C. 1975. Anal.Biochem. 99:474-476, использующийся в Институте белка РАН. На сколько я помню по собственному опыту чувствительность чуть ниже, чем при использовании кумасси R-250, но метод (i) очень быстр; (ii) гель именно "проявляется", то есть читать можно в процессе окрашивания, а не отмывки.

В разделе "Методы" появился новый протокол "Выделение pDNA (максипреп - очистка с PEG)". Прислала Анна Малашичева (anna.malashicheva@ens-lyon.fr). Большое ей спасибо!

Ещё один протокол от Степана Белякина (belyakin@embl-heidelberg.de) в разделе "Методы/Выделение DNA из эукариот": Выделение геномной DNA с Dispase II. Dispase II - дешёвая альтернатива Proteinase K. Автору - большое спасибо.

На сайте появилась новая JavaScript программка "Расчёт параметров PCR". Она помогает оценить сбалансированность PCR реакции (по нуклеотидам и праймерам) и необходимое число циклов. Рассчитывается общее количество и концентрация полученного продукта. Оценивается, с какого цикла амплификация перестаёт быть экспоненциальной. Программа сама выбирает наиболее удобные единицы измерения для представления результатов ("µg/µl", "ng/µl" или "pg/µl"). Можно выбрать единицу измерения самому, программа спорить не станет и пересчитает.

В разделе "Методы/Выделение DNA из эукариот" появился новый протокол: 14_06 Выделение геномной ДНК (Holmes-Bonner). Proteinase K не используется. В качестве денатурирующего агента введена мочевина. Прислал Степан Белякин (belyakin@embl-heidelberg.de).

Новость, не совсем относящаяся к сайту. Так сложилось, что мы теперь ведём и коллекцию протоколов лаборатории Hans Lehrach в Max-Planck-Institut fur Molekulare Genetik. Страница только что организована и материалов там пока немного. К тому же, мы всё выкладываем без просмотра и редактирования. Так что было решено, что постоянную ссылку пока организовывать не стоит, но те, кому интересно, могут сходить по адресу http://www.molgen.mpg.de/research/lehrach/protocols/, а потом "Protocols". Или напрямую: http://www.molgen.mpg.de/~soldatov/protocols/protocol/.

У меня наконец появилась надежда запомнить обозначения полиморфных нуклеотидов. Оказывается они подчиняются довольно простым мнемоническим правилам.

Символ Обозначает Объяснение R A или G puRine Y C или T pYrimidine M A или C aMino K G или T Keto S C или G сильное /Strong/ взаимодействие - три водородные связи W A или T слабое /Weak/ взаимодействие - две водородные связи H (A, C, T) но не G H следует за G в алфавите B (C, G, T) но не A B следует за A в алфавите V (A, C, G) но не T(U) V следует за T(U) в алфавите D (A, G, T) но не C D следует за C в алфавите N (A, G, C, T) любое основание / Nucleotide

В разделе "Методы" появился новый раздел "Работа с Drosophila melanogaster" и в нём три протокола: "Приготовление корма для мух", "Разведение D.melanogaster в больших количествах" и "Сбор эмбрионов D.melanogaster". Материалы подготовили Павел Марданов и Дарья Копытова из Института Биологии Гена.