Гребневики возникли в ходе эволюции более 500 млн. лет назад. Это необычные, своеобразно устроенные животные. Особенности их биологии, а также систематическое положение в животном царстве является предметом оживленной дискуссии. Не так давно сообщалосьо секвенировании генома гребневика Mnemiopsis. В последнем выпуске Nature сообщается о секвенировании второго генома гребневика, Pleurobrachia bachei. Кроме генома P. bachei, авторы секвенировали транскриптомы еще десяти гребневиков. Первый автор этой статьи и инициатор проекта – наш бывший соотечественник, нейробиолог Леонид Мороз – уже давно высказывал идею о независимом возникновении нервной системы (НС) у гребневиков. В свете новых данных эта гипотеза, похоже, приобрела серьезные подтверждения.

Во-первых, филогенетический анализ подтверждает предположение, что гребневики являются наиболее древней ветвью многоклеточных животных. Стало быть, отсутствие НС у трихоплакса и губок (эволюционно более поздних организмов) может быть объяснено или ее вторичной утратой, или независимым появлением у гребневиков и всех остальных животных. Во-вторых, многие гены, необходимые для построения НС, у гребневика отсутствуют. Кроме того, те гомологи нейрон-специфических генов, которые у гребневиков есть, экспрессируются у них не в нейронах, а в других типах клеток. Практически все известные НС используют около десяти видов нейротрансмиттеров, тогда как гребневик использует только два – глутамат и, возможно, нейропептиды. Казалось бы, такая простота должна отразиться и на примитивности строения нервной системы. Однако, гребневики являются вполне успешными активными хищниками, обладают способностью к фоторецепции и к восприятию силы тяжести. Это требует определенного уровня организации НС для восприятия и обработки информации. У гребневика хорошо развиты электрические синапсы, отсутствующие у трихоплакса, губок и примитивных книдарий. В-третьих, паттерн экспрессии некоторых генов, играющих ключевую роль в пространственной разметке НС всех остальных животных (например, Wnt) также сильно отличается от таковой у гребневиков. К другим необычным особенностям гребневиков можно отнести отсутствие микроРНК или знаменитых HOX-генов, определяющих разметку тела у большинства животных (в т.ч. и НС!). Зато у них широко представлены РНК-редактирующие (ADAR1–4, ADAT1–3, CDA1–2) и РНК-связывающие белки (RRM/ELAV, KH andNOVAs), обеспечивающие пост-транскрипционное разнообразие, пространственное распределение РНК и регуляцию экспрессии генов.

Все эти данные свидетельствуют о глубоком своеобразии организации НС гребневиков, и говорят о ее независимом происхождении у этих удивительных животных. Таким образом, новые данные об эволюции свидетельствуют против концепции постепенного увеличения сложности НС и наносят новые удары по антропоцентрической картине животного мира.

Картинка из news and views к рассматриваемой статье.
A – внешний вид P. bachei
B – систематическое положение гребневиков в животном царстве

Источники:
Moroz et al. The ctenophore genome and the evolutionary origins of neural systems. Nature (2014)

Hejnol. Evolutionary biology: Excitation over jelly nerves. News and Views

Callaway. Jelly genome mystery News in Focus

---

Поблагодарили (11): ship, Vadim Sharov, le lapin, Esya, campus, Serpent, AlexRez, Dima DD, NMR-guy, Lanik, nadako

Мутации, обычно возникающие при колоректальном раке, вызывают прогрессирующее накопление микроРНК miR-135b. Она, в свою очередь, действует как сильный драйвер прогрессии рака влияя на работу ряда сигнальных путей, подавляя экспрессию анти-онкогенов. МiR-135b можно использовать как информативный маркер инициации и прогрессии рака и, вероятно, как мишень для терапии.

МикроРНК (miR) представляют собой некодирующие РНК, участвующие в поддержании гомеостаза клетки и в канцерогенезе. Экспрессия некоторых из них нарушается при колоректальных раках (colorectal cancers (CRCs)). Однако не было известно, являются ли эти нарушения побочным событием канцерогенеза, или miR участвуют в прогрессии опухоли in vivo.

Авторы сравнили профили экспрессии miR в опухолях и нормальных тканях на двух мышиных моделях CRC. У одной из них нарушалась экспрессия 35 miR – семи из них усиливалась и четырнадцати подавлялась более чем в два раза. У другой - экспрессия тринадцати из 57 miR усиливалась, а девяти подавлялась более чем в два раза. В обоих случаях наиболее сильно активировалась экспрессия miR-135b, на которую и обратили внимание.

Далее были проанализированы miR у 454 пациентов со спорадическим CRC и 31 пациент с CRC, связанным с воспалением кишечника. В случаях спорадического CRC экспрессия miR-135b была усилена в среднем в 4 раза по сравнению с нормальной тканью и усиливалась по мере прогресии опухоли. Во второй когорте пациентов экспрессия miR-135b также была заметно усилена. Примечательно, что усиление наблюдалось и в участках предшествующей раку дисплазии по сравнению с нормальной тканью. Вероятно, это раннее событие при развитии CRC.

Мутации в гене АРС – твердо установленный индуктор CRC. Введение гена дикого типа в культуру человеческих CRC-клеток с мутантным аллелем АРС на 65% подавляло экспрессию miR-135b, а введение анти-АРС siРНК в 5 раз усиливало ее экспрессию в культуре нормальных клеток кишечного эпителия.

Мутации АРС приводят к стабилизации и транслокации в ядро ß-катенина, где он индуцирует сложную программу транскрипции. В культуру клеток вводили активно экспрессирующийся ген ß-катенина, или стабилизировали ß-катенин обработкой клеток LiCl. В обоих случаях это приводило к усилению экспрессии miR-135b в 3-4,6 раз. Введение в клетки siРНК, блокирующих различные этапы пути АРС/ß-катенин, подавляло miR-135b. Следовательно, экспрессия miR-135b может быть активирована в результате срабатывания пути АРС/ß-катенин/TCF4-LEF1. Эксперименты на различных линиях CRC-клеток человека, на мышиных фибробластах, несущих мутации, характерные для CRC человека, на органоидных культурах из CRC опухолей мутантных мышей показали, что с активацией miR-135b могут быть связаны функции и других путей.

Эксперименты по подавлению или активации miR-135b в различных культурах клеток показали, что активация miR-135b подавляет апоптоз и стимулирует рост клеток. Введение CRC-мышам анти-miR-135b олигонуклеотидов существенно уменьшало количество и размеры опухолей. В опухолях усиливался апоптоз. Никаких побочных эффектов при такой терапии не наблюдалось.

Для поиска генов, на которые может влиять усиленная экспрессия miR-135b, был проведен анализ экспресии генов в клетках нормального эпителя кишечника с искусственно усиленной экспрессией miR-135b. Анализ генов, которые могут быть ассоциированы с канцерогенезом, показал, что при этом нарушается экспрессия 35 из них. Так, подавляется экспрессия TGFßR2, DAPK1, APC. В то же время усиливается экспрессия IL8, VEGFA.

В результате исследований на моделях in vitro и in vivo авторам удалось расшифровать генетические события, приводящие к усилению экспрессии miR-135b. МiR-135b можно использовать как информативный и репродуцирующийся биологический маркер для диагностики и клинического прогноза CRC. Усиление экспрессии miR-135b – маркер даже ранних стадий канцерогенеза. Подавление miR-135b может стать методом эффективной адресной терапии CRC с минимальными побочными эффектами.


Источник: Valeri N, Braconi C, Gasparini P, Murgia C, Lampis A, Paulus-Hock V, Hart JR, Ueno L, Grivennikov SI, Lovat F, Paone A, Cascione L, Sumani KM, Veronese A, Fabbri M, Carasi S, Alder H, Lanza G, Gafa' R, Moyer MP, Ridgway RA, Cordero J, Nuovo GJ, Frankel WL, Rugge M, Fassan M, Groden J, Vogt PK, Karin M, Sansom OJ, Croce CM. MicroRNA-135b Promotes Cancer Progression by Acting as a Downstream Effector of Oncogenic Pathways in Colon Cancer. // Cancer Cell. 2014; V. 25: P. 469-483.

Подпись к рисунку: Генетические нарушения, вызывающие усиленную экспрессию miR-135b и мишени, на которые она воздействует.

Одно из необходимых условий для поддержания клеточного гомеостаза – сохранение постоянного объема клетки в условиях осмотических изменений как внутри клетки, так и во внеклеточной среде. Снижение внеклеточной осмолярности (или повышение внутриклеточной осмолярности) ведет к быстрому поступлению воды в клетки, что вызывает их набухание. Это, в свою очередь, активирует трансмембранный поток анионов (в основном, ионов хлора) в направлении из клетки наружу, что необходимо для снижения объема клетки. Известно, что ключевую роль в этом процессе играют мембранные ионные каналы, в частности, так называемые регулируемые объемом анионные каналы (volume-regulated anion channel, VRAC). Этим термином с начала 2000-х обозначают функциональный комплекс, отвечающий за мембранный транспорт ряда анионов, аминокислот и органических осмолитов. Однако молекулярный состав этого комплекса долгое время оставался неизвестным, что, безусловно, затрудняло дальнейшее изучение механизма его работы. Лишь недавно коллективу исследователей под руководством Ardem Patapoutian из Института Скриппса удалось решить эту проблему и идентифицировать ключевой компонент комплекса VRAC – белок, получивший название SWELL1. Результаты исследования опубликованы в Cell.

С помощью метода РНК-интерференции авторы провели скрининг более 20 000 генов в клетках линии HEK293T, выращенных в среде с низким содержанием солей (т.е. с низкой осмолярностью). Было показано, что ингибирование гена SWELL1 (ранее известного как leucine-rich repeat–containing gene 8А, LRRC8A) предотвращало высвобождение ионов хлора из клеток, в результате клетки оставались в набухшем состоянии. Как и следовало ожидать, белок SWELL1 локализован на плазматической мембране и характеризуется широкой тканевой экспрессией. Интересно, что белок встроен в мембрану достаточно необычным образом. Ранее считалось, что лейциновые повторы у трансмембранных белков должны располагаться с внешней стороны мембраны. В случае SWELL1, они расположены с внутренней стороны.

Показано, что SWELL1 образует в мембране структуры, напоминающие поры. Однако маловероятно, что белок выполняет функцию ионного канала сам по себе. Кроме того, оверэкспрессия SWELL1 не ведет к повышению активности VRAC в клетке. Таким образом, в вопросе функционирования VRAC все еще остается множество «белых пятен». Остается неизвестным, как именно ионные каналы воспринимают осмотические стимулы и реагируют на них. В дальнейшем исследователи планируют вставить выделенный белок в искусственный липидный бислой, с целью детального изучения активности SWELL1 и влияния на нее других белков и активаторных молекул.

Важнейшее наблюдение авторов заключается в том, что нокдаун SWELL1 ведет к нарушению потока ионов через VRAC, в результате клетки не могут вернуться к нормальному физиологическому объему после набухания. При этом точечные мутации в SWELL1 сильно влияют на анионную селективность VRAC. Эти данные подтверждают ключевую роль SWELL1 в работе VRAC и открывают новые возможности для изучения механизма функционирования ионного канала в норме и патологии. Предыдущие исследования показали, что данный канал активируется в процессе набухания тканей головного мозга и может играть роль в патогенезе инсульта, а также вовлечен в секрецию инсулина клетками поджелудочной железы. Соответственно, идентификация ключевого компонента VRAC делает возможным поиск мутаций в кодирующем его гене, ассоциированных с развитием разнообразных заболеваний, включая инсульт и диабет.


Источник: Qiu Z, Dubin AE, Mathur J, Tu B, Reddy K, Miraglia LJ, Reinhardt J, Orth AP, Patapoutian A. SWELL1, a Plasma Membrane Protein, Is an Essential Component of Volume-Regulated Anion Channel. Cell. 2014. 157(2):447-58.

Подпись к рисунку: Графический абстракт к обсуждаемой статье.

---

Поблагодарили (10): xenopus, Lanik, AlexRez, DK., Vadim Sharov, kasumov eldar, muripabi, Shanty, interference, Sekap

Взаимосвязь клональной архитектуры и функциональной гетерогенности клеток при острой миелоидной лейкемии пока мало изучена. Полученные в работе результаты показывают важность и эффективность комбинированного изучения генетических параметров и функционального анализа образцов от пациентов, включая исследования на ксенографтных моделях.

Рак представляет собой эволюционный процесс возникновения в клетках соматических мутаций и отбора клеток, наиболее приспособленных к существованию. Во всех клонах клеток наследуются мутации “клона основателя”, но различные клоны гетерогенны по другим позже приобретенным мутациям. Кроме этой генетической гетерогенности, существует и связанная с ней функциональная гетерогенность, но их связь пока мало изучена.

Новые технологии секвенирования позволили приступить к детальному изучению гетерогенности клеток при раке. Исследования главным образом сконцентрировались на поиске и характеристике клеток инициирующих рак – стволовых раковых клеток. Главной целью данной работы был поиск взаимоотношений генетической и функциональной гетерогенности на модели острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) путем анализа генетически различных субклонов по ряду признаков.

Было проведено полное секвенирования геномов ОМЛ нефракционированных клеток костного мозга 19 пациентов. Спектр мутаций у всех соответствовал франко-американско-британским подтипам заболевания. Ряд мутаций присутствовал в гетерозиготном состоянии практически во всех клетках, что свидетельствовало о происхождении их из единого клона-предшественника. Но были и мутации, обнаруживаемые с более низкой частотой, что означало возникновение новых мутаций в ходе эволюции.

Секвенирование геномов клеток ОМЛ, циркулирующих в периферической крови, в 13 из 19 случаев не выявило практически никаких отличий от костного мозга. В остальных случаях наблюдались небольшие, но достоверные различия в количественном наборе мутаций. В общем же все варианты, присутствовавшие в костном мозге, обнаруживались и в крови. Анализ расфракционированных по различным маркерам с помощью проточной цитометрии элементов крови показал, что субклоны ОМЛ присутствуют в них примерно в одинаковых пропорциях.

Некоторые субклоны ОМЛ оказались функционально различными по способности дифференцироваться в более зрелые клетки. Были выделены индивидуальные клетки, и после полногеномной ПЦР-амплификации они были проверены на наличие десяти мутаций и девяти полиморфизмов. Среди них идентифицированы 10 лейкемических вариантов, обнаруживавшихся и в костном мозге, и в периферической крови. Некоторые субклоны имели особые функциональные свойства, проявлявшиеся in vitro. Так, субклон варианта 3 имел существенные преимущества по скорости роста в специальных условиях культивирования. Он же оказался доминирующим при рецидивах заболевания.

Эксперименты по трансплантации клеток ОМЛ иммунодефицитным мышам показали различную способность субклонов приживаться в организме животных. В ксенографтах преимущественно обнаруживались потомки одного субклона, но не обнаруживалось корреляции с его положением в эволюционной иерархии при лейкемии.


Источник: Klco JM, Spencer DH, Miller CA, Griffith M, Lamprecht TL, O'Laughlin M, Fronick C, Magrini V, Demeter RT, Fulton RS, Eades WC, Link DC, Graubert TA, Walter MJ, Mardis ER, Dipersio JF, Wilson RK, Ley TJ. Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia. // Cancer Cell. 2014; V. 25: P. 379-392.

Подпись к рисунку: Модель архитектуры субклонов и их предсказанные фенотипы у одного из ОМЛ пациентов. NSG и NSG-SGM3 – различные линии иммунодефицитных мышей.

---

Поблагодарили (3): NMR-guy, Агроном, AlexRez

Моторные белки осуществляют конверсию химической энергии в механическую работу за счет гидролиза АТФ, что позволяет им перемещаться в клетке по системе филаментов. Семейство моторных белков, к которому относится кинезин-5, играет важную роль в процессе митоза, так как необходимо для формирования и функционирования митотического веретена. Митотическое веретено обеспечивает распределение хромосом между дочерними клетками в результате согласованного движения сложного комплекса микротрубочек. Движение антипараллельных микротрубочек относительно друг друга в противоположных направлениях осуществляется функциональным комплексом кинезина-5, который представляет собой гомотетрамер, имеющий 2 моторных конца (по 2 моторных домена в каждом), связанных центральным стержнем.

Группа исследователей из Калифорнийского Университета в Дэвисе под руководством Jawdat Al-Bassam недавно представила новые данные о структуре центрального стержня кинезинового мотора, объясняющие механизм его функционирования. С помощью электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа было показано, что основой центрального стержня является домен нового типа, названный авторами BASS (bipolar assembly) и состоящий из четырех биполярно ориентированных длинных спиралей, тесно переплетенных между собой на протяжении 26 нанометров. На сегодняшний день это длиннейшая экспериментально охарактеризованная спиральная белковая структура. Такое строение центрального стержня обеспечивает правильную пространственную ориентацию мономеров в комплексе, механическое сопряжение и распределение усилия между двумя противоположными моторными концами кинезина-5, а также сильное сопротивления комплекса растягивающей силе. Еще одно интересная особенность структуры BASS заключается в переплетении 2-х димеров в комплексе таким образом, что моторные концы располагаются под углом в 90° друг к другу. Предполагается, что при приложении внешней силы этот угол может изменяться, что «запускает» мотор и заставляет его поворачивать связанные микротрубочки относительно друг друга вокруг продольной оси комплекса. В целом, уникальная структура домена BASS объясняет принцип работы кинезинового мотора и его участие в перемещении именно антипараллельных микротрубочек.

Авторы также обнаружили 2 «молекулярных кармана» на поверхности белка, которые можно использовать в качестве сайтов связывания для создания низкомолекулярных ингибиторов кинезина-5. Предполагается, что такие ингибиторы будут способны нарушать структуру домена BASS и предотвращать формирование функциональных тетрамеров кинезина. Это, в свою очередь, будет нарушать процесс клеточного деления. Учитывая роль неконтролируемого деления клеток в патогенезе многих видов рака, потенциальные ингибиторы кинезина-5 могут оказаться эффективными компонентами противораковой терапии.


Источник: Scholey JE, Nithianantham S, Scholey JM, Al-Bassam J. Structural basis for the assembly of the mitotic motor Kinesin-5 into bipolar tetramers. Elife. 2014. 3:e02217.
Комментарий: Fakhri N, Schmidt CF. A surprising twist. Elife. 2014. 3:e02715.

Статьи в свободном доступе.

Рисунок из обсуждаемой статьи: схематическая модель функционирования моторного комплекса кинезина-5, демонстрирующая роль домена BASS в распределении усилия между двумя моторными концами комплекса, осуществляющего движение микротрубочек.

---

Поблагодарили (2): kasumov eldar, epsylonit

Клоны злокачественных клеток при острой лимфобластоидной лейкемии проходят постоянную спонтанную эволюцию, приводящую к ускорению прогрессии заболевания, рецидивам и независимому от присутствия препарата приобретению устойчивости к терапии. Приобретение этих свойств связано с активацией пути Akt/mTORC1. Возможно, комбинация ингибиторов PI3K/Akt в сочетании с глюкокортикоидами станет эффективным методом лечения этой лейкемии.

Рак – эволюционный процесс в ходе которого трансформированные клетки накапливают генетические и эпигенетические нарушения. В результате образуются функционально различные опухолевые клетки. В процессе естественной селекции преимущество получают клоны, наиболее приспособленные к прогрессии рака, вызывающие рецидивы и устойчивые к терапии.

Генетическая гетерогенность опухоли приобретает все большее значение как признак прогрессии рака, клинического прогноза, чувствительности к терапии. Но пробы, взятые от пациентов, содержат множество мутаций, и трудно определить, какие мутации из этого разнообразия связаны с прогрессией рака.

Прогрессия и рецидивы рака связаны с редкими “продвигающими” (propagating) клетками, в случае лейкемий - leukemia-propagating cells (LPCs). Несмотря на успехи в терапевтическом лечении Т-клеточной острой лимфобластоидной лейкемии (T-ALL), у большинства пациентов происходят рецидивы, возникающие из-за переживающих терапию LPCs, которые приобретают устойчивость к ней. Рецидивы T-ALL связаны с клональной эволюцией, при которой клетки приобретают устойчвость к лекарствам, ускоренный рост, и наблюдается прогрессия заболевания.

Эксперименты по клональной эволюции LPCs при T-ALL проводились на рыбках Danio rerio. По многим молекулярным признакам T-ALL у них очень сходна с этим заболеванием у человека. Популяцию клеток T-ALL Danio rerio, меченых флюоресцентными белками, получали путем индукции Мус. Единичные LPCs пересаживали сингенным рыбам, затем повторяли эту процедуру еще трижды. Прослеживались эволюция LPCs по частоте и времени наступления рецидива. Клоны, полученные из единой популяции T-ALL, существенно различались по фенотипам, по частоте LPCs в новообразованиях и латентному периоду. Полученные данные показали разветвленную эволюцию LPCs.

Латентность T-ALL и способность к развитию лейкемии регулируются различными молекулярными механизмами. Активация роста T-ALL и увеличение частоты LPCs в результате клональной эволюции были связаны с активацией Akt. Ингибитор Akt не только снижал долю LPCs в популяции клеток, но и эффективно убивал LPCs. Сигналы через Akt могут стимулировать рост T-ALL по двум путям: ускоряя пролиферацию вследствие стабилизации белка Мус и увеличивая частоту LPCs вследствие активации mTORC1.

Ранее было известно, что лечение T-ALL глюкокортикоидом дексаметазоном часто приводит к развитию резистентности связанным с утратой функции PTEN и с активацией пути Akt. Действительно, клональная эволюция даже в отсутствие дексаметазона приводила к активации пути Akt и резистентности к препарату. Однако, комбинированная терапия дексаметазоном и ингибитором Akt МК2206 эффективно подавляла клетки T-ALL и приводила к практически полной регрессии заболевания.

Таким образом показано, что клоны T-ALL проходят постоянную спонтанную эволюцию, приводящую к ускорению прогрессии лейкемии и независимому от присутствия препарата приобретению устойчивости к терапии. Ранее испытания соединения МК2206 как препарата против лейкемии и сОлидных опухолей имели лишь частичный успех из-за его высокой токсичности. Но теперь, вероятно, целесообразно провести преклинические испытания различных ингибиторов PI3K/Akt в комбинации с глюкокортикоидами как многообещающей стратегии для лечения T-ALL.


Источник: Blackburn JS, Liu S, Wilder JL, Dobrinski KP, Lobbardi R, Moore FE, Martinez SA, Chen EY, Lee C, Langenau DM. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency in T Cell Acute Lymphoblastic Leukemia through Akt/mTORC1 Pathway Activation. // Cancer Cell. 2014; V. 25: P. 366-378.

Подпись к рисунку: Эволюция различных клонов злокачественных клеток при острой лимфобластоидной лейкемии. Последовательная трансплантация сингенным Danio rerio. Дроби – частота LPCs.
* - сильное увеличение частоты LPCs во вторичном трансплантанте по сравнению с первичным,
** - сильное увеличение частоты LPCs в третичном трансплантанте по сравнению с вторичным.

В последнее время активно развиваются технологии визуализации живых клеток и тканей, в том числе с использованием флуоресцентных белков. Кроме того, что они позволяют получать не доступную другими методами информацию, это еще и чрезвычайно красиво — чего только стоит, например, знаменитая технология brainbow, позволяющая дифференциально «раскрашивать» индивидуальные нейроны развивающегося мозга (да и не только мозга)!

В свежей статье в журнале Development сообщается о еще одной вариации на флуоресцентную тему. Авторы визуализировали различные нейрональные субтипы в развивающейся сетчатке глаза рыбы Danio – традиционного объекта эмбриологических исследований. Свою технологию авторы назвали «Spectrum of Fates». Ее суть проста — гены разных флуоресцентных белков поставили под контроль промоторов генов трех транскрипционных факторов. Для этой цели были выбраны гены Atoh7, Ptf1a и Crx: их различные комбинации перекрывают основные типы нейронов сетчатки. Таким образом, в отличие от brainbow, где цвет отдельной клетки формируется случайно и не несет биологического смысла, метод Spectrum of Fates позволяет соотносить каждый спектр с определенной клеточной дифференировкой.

Используя данный подход, авторам удалось проследить с хорошим пространственно-временным разрешением последовательность волн эмбриональных дифференировок, развитие нейропиля, судьбы клеток и их иерархию (lineage tracing and hierarchies of fates), а также выяснить влияние нокдауна ряда генов на развитие эмбрионального зачатка сетчатки. В перспективе авторы планируют исследовать с помощью Spectrum of Fates процессы регенерации сетчатки у взрослых рыб. Кроме того, добавление кальциевых сенсоров (о которых уже упоминалось в новостях на molbiol.ru) позволит проследить и формирование синапсов. Это поможет лучше понять, как в ходе эмбриогенеза формируется система первичной обработки зрительной информации. Ну и, конечно, сам принцип может быть распространен на разные организмы, системы и процессы (регуляция клеточного цикла, транскрипционные факторы, сигнальные каскады и т. д.)


Источник: Almeida et al. Spectrum of Fates: a new approach to the study of the developing zebrafish retina. Development. 2014 May;141(9):1971-80.

Картинка из обсуждаемой статьи: саггитальный разрез сетчатки, 120 ч после оплодотворения, трансгенная линия "SoFa1" (Atoh7:gapRFP/Ptf1a:cytGFP/Crx:gapCFP).

---

Поблагодарили (8): Replikant, Pharmaсol, Serpent, NMR-guy, epsylonit, Vladimirkox, KooT, Lanik

Детальное секвенирование транскриптом линий клеток гепатоцеллюлярной карциномы, положительных по наличию вируса гепатита В, выявило во многих из них активную транскрипцию химерной последовательности НВх-LINE1. Этот транскрипт, подобный длинным некодирующим РНК, обладает свойствами промотора канцерогенеза, активирующим сигнальный путь Wnt/β-катенин.

Хроническое носительство вируса гепатита В (HBV) в 100-200 раз повышает риск возникновения гепатоцеллюлярной карциномы. С одной стороны, длительная репликация вируса, экспрессия его белков приводят к воспалению печени, циррозу и в конечном итоге к раку. С другой стороны, возможен прямой онкогенный эффект интеграции вирусного генома. Было показано, что геном HBV интегрируется в различные гены, но чаще всего в повторяющиеся последовательности (длинные рассеянные ядерные элементы-транспозоны LINE, короткие рассеянные ядерные элементы SINE, последовательности Alu) или вблизи них. До сих пор исследовалось в основном влияние интеграции HBV на экспрессию клеточных генов. Эффекты внедрения HBV в повторяющиеся последовательности практически не анализировались.

Авторы исследовали транскрибирующиеся химеры HBV и клеточных последовательностей нуклеотидов. Они секвенировали транскриптомы из шести HBV-позитивных клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы (HKCI). В четырех из них обнаружены один или несколько химерных транскриптов. Многие из них представляли собой слияние HBV с межгенными последовательностями содержащими повторы типа LINE и SINE, другие – слияния с различными генами, среди них CHIC2, UPF3A, ZNF48, METAP1, TPCN2, TERP. Точки разрыва генома HBV обычно находились в генах HBs, HBx или между HBx и HBс. Данные, полученные на транскриптомах, были подтверждены секвенированием соответствующих участков геномов.

Встраивание HBV в участки генома, транскрибирующиеся и без него, не оказывало существенного влияния на интенсивность транскрипции. Однако инсерция HBV привела к активной транскрипции ранее молчавшей последовательности LINE1, локализованной в нетранскрибируемом гетерохроматине в области хромосомы 8р11.21. Включалась также транскрипция НВс-LINE2, НВх-SINE в других областях генома, но ее интенсивность была намного ниже, чем НВх-LINE1.

НВх-LINE1 была подвергнута детальному исследованию. Её активная транскрипция наблюдалась в 21 из 90 (23%) гепатоцеллюлярных карцином. Выживаемость таких пациентов была существенно снижена. Для проверки предположения, что экспрессия НВх-LINE1 имеет биологические последствия, были поведены нокдаун-эксперименты на линиях клеток, экспрессирующих НВх-LINE1. Соответствующие siРНК сильно подавляли мобильность клеток и их способность к инвазивному росту. Поскольку усиление этих свойств клеток обычно связано с эпителиально-мезенхимальной транзицией, был исследован эффект экспрессии НВх-LINE1 как модулятора транзиции. Подавление с помощью siРНК усиливало экспрессию эпителиальных маркеров Е-кадхерина и γ-катенина, и ослабляло экспрессию мезенхимального фибронектина. Транскрипция НВх-LINE1 активировала сигнальный путь Wnt/β-катенин.

Функциональным эффектом обладал только полный транскрипт НВх-LINE1 длиной 674 нуклеотида, но не его усеченные варианты НВх-LINE1^1-312, НВх^1-297 или LINE1^295-674. Введение в НВх-LINE1 стоп-кодонов, блокирующих трансляцию, на его свойства не влияло. У трансгенных мышей, которым была введена клонированная НВх-LINE1, под действием диэтил-нитрозамина гораздо быстрее чем у животных дикого типа развивалась гепатоцеллюлярная карцинома.

Таким образом показано, что в результате внедрения в область хромосомы 8р11.21 последовательностей генома HBV происходит эффективная транскрипция химеры НВх-LINE1. В дополнение к ранее известной активности транспозона LINE1 как фактора мутагенеза продемонстрирован онкогенный эффект химеры как промотора гепатоцеллюлярной карциномы. Транскрипт химеры НВх-LINE1 вероятно, представляет собой аналог длинных (>200 нуклеотидов) некодирующих РНК, для которых показано или предполагается участие во многих биологических процессах, происходящих в клетке. Полученные результаты могут послужить основой для более глубокого понимания роли хронической инфекции HBV в патогенезе рака.


Источник: Lau CC, Sun T, Ching AK, He M, Li JW, Wong AM, Co NN, Chan AW, Li PS, Lung RW, Tong JH, Lai PB, Chan HL, To KF, Chan TF, Wong N. Viral-human chimeric transcript predisposes risk to liver cancer development and progression. // Cancer Cell. 2014; V. 25: P. 335-349.

Подпись к рисунку: Химерная последовательность НВх-LINE1. Обозначены стартовый кодон трансляции ATG в НВх и терминирующий кодон TGA в LINE1. Синим цветом показана вирусная последовательность нуклеотидов, черным – последовательность человека. GTG – микрогомология в точке сочленения.

---

Поблагодарили (7): Erin, ship, Vadim Sharov, Агроном, NMR-guy, BIOWOLF, AlexRez

SGK1 (serum and glucocorticoid-regulated kinase 1) – сериновая/треониновая протеинкиназа, вовлеченная в регуляцию множества белков и соответствующих процессов, включая клеточный ответ на стресс, пролиферацию и апоптоз. Активация SGK1 происходит с участием киназного комплекса mTORC2, являющейся ключевым компонентом сигнального пути, ответственного в том числе за передачу внешних стимулов и запуск дифференциации в Т-лимфоцитах.

Авторы работы, опубликованной в Nature Immunology, изучали возможное участие SGK1 в регуляции дифференциации Т-клеток. Им удалось показать, что SGK1 способствует дифференциации в Т-хелперы 2-го типа (Th2) за счет двух молекулярных механизмов. В первом случае, SGK1 фосфорилирует и инактивирует убиквитин-лигазу Nedd4-2, ответственную за деградацию транскрипционного фактора JunB. В результате JunB запускает экспрессию цитокинов и факторов транскрипции, необходимых для дифференциации лимфоцитов по типу Th2.

Второй механизм реализуется путем контроля экспрессии другого транскрипционного фактора – TCF-1. Фосфорилируя компоненты соответствующего сигнального пути, SGK1 подавляет экспрессию TCF-1, что в итоге приводит к подавлению продукции гамма-интерферона (IFN-γ) и других факторов, стимулирующих дифференциацию по типу Th1. Таким образом, SGK1 одновременно стимулирует Th2-дифференциацию и ингибирует Th1-дифференциацию.

Полученные данные, помимо ценности для понимания механизмов дифференциации, потенциально имеют и конкретное практическое применение. Известно, например, что Th2-клетки вовлечены в патогенез аллергической астмы. Проведенные на генно-инженерных мышах эксперименты показали, что мыши с делецией SGK1 в Т-клетках устойчивы к экспериментально индуцируемой астме. Т-лимфоциты с делецией SGK1 фенотипически соответствовали Th1-клеткам, которые в норме ответственны за антивирусный и противоопухолевый иммунный ответ. Дальнейшие эксперименты подтвердили, что животные с такими лимфоцитами вырабатывают значительное количество IFN-γ в ответ на вирусную инфекцию и инъекцию опухолевых клеток. При этом у мышей с делецией SGK1 количество образовавшихся в результате опухолей было в 2 раза ниже по сравнению с мышами дикого типа.

Таким образом, применение специфических ингибиторов SGK1 может оказаться эффективным методом настройки иммунного ответа, и в перспективе может использоваться в терапии ряда тяжелых патологий, включая автоиммунные заболевания и злокачественные новообразования.


Источник: Heikamp EB, Patel CH, Collins S, Waickman A, Oh MH, Sun IH, Illei P, Sharma A, Naray-Fejes-Toth A, Fejes-Toth G, Misra-Sen J, Horton MR, Powell JD. The AGC kinase SGK1 regulates TH1 and TH2 differentiation downstream of the mTORC2 complex. Nat Immunol. 2014. 15(5):457-64.
Комментарий к статье: Norton M, Screaton RA. SGK1: master and commander of the fate of helper T cells. Nat Immunol. 2014. 15(5):411-3.

Подпись к рисунку: Схема SGK1-опосредованной регуляции дифференциации Т-клеток. Рисунок из комментария к обсуждаемой статье.

Недавно опубликованные в Cell результаты исследований двух независимых научных групп показали, что точечная мутация в гене cleavage and polyadenylation factor I subunit 1 (CLP1) вызывает нарушение развития мозга и нейродегенеративное расстройство у младенцев. Заболевание характеризуется прогрессирующей микроцефалией, нарушением моторных навыков, речи, конвульсивными припадками и прогрессирующей мышечной слабостью. Магнитно-резонансная томография показывает отклонение от нормы в развитие структур головного мозга детей с признаками заболевания. Проявляются такие нарушения развития, как дисгенезия коры головного мозга, выраженная упрощением структуры извилин, дистрофия мозолистого тела и уменьшение объема мозга у некоторых пациентов. Расширенный анализ не выявил определенные нарушения метаболизма и нейродегенеративные процессы, что говорит о ранее неизвестной природе заболевания.

CLP1 – ген мультифункциональной киназы, вовлеченной в процесс созревания матричной, транспортной и малой интерферирующей РНК. Точечная мутация в гене G419A, соответствующая замене R140H в белке, ведет к падению активности мутантной киназы, что нарушает правильное расщепление эндонуклеазного комплекса и препятствует образованию зрелой тРНК. Данный дефект обуславливает стресс-индуцированный апоптоз и нейродегенерацию.

Ученые из группы James Lupski из Baylor College of Medicine в Хьюстоне секвенировали экзомы пяти пациентов из Турции с характерными признаками заболевания и их родственников, обнаружив мутацию в гене СLP1. Их коллега Josef Penninger из the Austrian Academy of Sciences в Вене провел ряд модельных экспериментов на мышах и показал, что мутация СLP1 влияет на выживание стволовых клеток мозга.

Вторая группа исследователей под руководством Murat Gunel из Yale University, Frank Bass из the Academic Medical Center в Амстердаме и Joseph Gleeson из the University of California, San Diego (UCSD) секвенировала экзомы более 2000 родственников заболевших детей, идентифицировав CLP1 в четырех независимых семействах.

Отмечается, что болезнь у носителей мутации не имеет симптоматики и клинических проявлений, позволяющих дифференцировать ее от других похожих расстройств нервной системы без генетического анализа.

Источник:
1) Karaca E et al. Human CLP1 Mutations Alter tRNA Biogenesis, Affecting Both Peripheral and Central Nervous System Function. Cell. 2014 Apr 24;157(3):636-50.
2) Schaffer AE et al. CLP1 Founder Mutation Links tRNA Splicing and Maturation to Cerebellar Development and Neurodegeneration. Cell. 2014 Apr 24;157(3):651-63.

Подпись к рисунку: МРТ-изображения черепа пациентов в сагиттальной проекции (верхний ряд) и аксиальной проекции (нижний ряд).

---

Поблагодарили (2): Vadim Sharov, xenopus

Консервативность процессов и путей, способствующих и препятствующих развитию опухоли в клетках человека и мышей, делает мышей, модифицированных с помощью генной инженерии, очень эффективной моделью исследования рака человека. На такой модели с использованием сравнительного секвенирования геномов прослежена последовательность молекулярных событий при формировании опухолей мелкоклеточной карциномы легких и предложена модель ее развития.

Мелкоклеточная карцинома легких (small cell lung carcinoma – SCLC) – высоколетальное заболевание, составляющее у курильщиков примерно четверть всех раков легких. Мишеней, которые можно использовать для химиотерапии SCLC, известно пока мало. К моменту обнаружения опухоли её клетки успевают накопить множество мутаций, среди которых есть как драйверы, определяющие прогрессию SCLC, так и множество нейтральных мутаций-”пассажиров”. Главной задачей проводимых в последнее время широкомасштабных работ по секвенированию раковых геномов является идентификация драйверов. Но эти работы иногда дают противоречивые результаты. Одной из существенных причин этого является отсутствие адекватной модели для проверки эффекта мутаций in vivo.

При SCLC часто наблюдаются инактивирующие мутации в генах TP53 и RB1. Поэтому для экспериментов были использованы мыши, у которых были делетированы соответствуюшие мышиные ортологи Tp53 и Rb1. У этих мышей достоверно воспроизводилась клиническая картина SCLC взрослого человека, включая длительный латентный период (12-14 месяцев) и часто развивающиеся метастазы.

Был создан банк мышиных тканей из первичных опухолей на различных стадиях прогрессии и метастазов. Проведено секвенирование экзомов 27 опухолей и метастазов и секвенирование полных геномов 14 опухолей. Для сравнения проводилось секвенирование ДНК из заведомо нормальной ткани из образцов хвостов. Выявлено множество повторяющихся хромосомных перестроек, включая дупликации и потери хромосом. Ряд перестроек был аналочичен таковым, наблюдающихся в человеческих ортологах при SCLC. Предварительные данные по точечным мутациям показывают специфичность их набора, и этот набор отличается от набора точечных мутаций у Kras^G12D/p53-null мышей – модели аденокарциномы легких.

Из точечных мутаций в SCLC мышей чаще других наблюдались мутации гена Pten, а также в других генах сигнального пути Pten. Часто наблюдалась и утрата хромосомы 19, в которой локализован Pten. Дефекты PTEN идентифицированы и в SCLC человека. Иммуногистохимическое исследование показало дефицит продукта Pten в опухолях по сравнению с нейроэндокринными тельцами, из которых опухоли развиваются. В то же время активизировались компоненты сигнального пути PI3K/AKT, который стимулируется в ответ на инактивацию пути Pten. Следовательно, нарушение пути Pten должно способствовать прогрессии опухоли. Это было прямо подтверждено на мышах, у которых кроме Tp53 и Rb1 был делетирован Pten. У них сильно сокращался латентный период развития опухолей и, как следствие, ускорялась гибель.

Изучение наборов мутаций в различных участках опухолей, в метастазах, формировавшихся в лимфатических узлах и в печени, позволило проследить клональную эволюцию индивидуальных клеток-предшественников и постепенное накопление соматических мутаций.

Проведенное исследование представляет собой наиболее полное описание молекулярных событий, происходящих в соматических клетках при развитии злокачественной опухоли. В отсутствие мутагенеза, вызванного табачным дымом или другими канцерогенами, обнаружено значительно меньше мутаций, чем присутствует в опухолях SCLC пациентов-курильщиков. Это позволило в занчительной мере отсечь «мутационный шум», достоверно установить последовательность молекулярных нарушений, предложить модель формирования и прогрессии SCLC. Консервативность способствующих и препятствующих развитию опухоли процессов и путей в клетках человека делает мышей, модифицированных с помощью методов генной инженерии, очень эффективной моделью исследования рака человека с использованием сравнительного секвенирования геномов.


Источник: McFadden DG, Papagiannakopoulos T, Taylor-Weiner A, Stewart C, Carter SL, Cibulskis K, Bhutkar A, McKenna A, Dooley A, Vernon A, Sougnez C, Malstrom S, Heimann M, Park J, Chen F, Farago AF, Dayton T, Shefler E, Gabriel S, Getz G, Jacks T. Genetic and clonal dissection of murine small cell lung carcinoma progression by genome sequencing. // Cell. 2014; V. 156: P. 1298-1311.

Подпись к рисунку: Модель онкогенеза при мелкоклеточной карциноме легких.

---

Поблагодарили (3): Alex2006, NMR-guy, Vadim Sharov

Чума – смертельно опасное заболевание, вызываемое бактерией Yersinia pestis. Хотя чумные пандемии, уносившие миллионы жизней, благодаря развитию медицины (в особенности применению антибиотиков) остались в прошлом, чума продолжает оставаться серьезной угрозой, особенной в развивающихся странах. В отсутствие лечения летальность наиболее тяжелой формы чумы – легочной – приближается к 100%.

Известно, что бактериальная протеаза Pla играет важную роль в патогенезе легочной чумы и в модуляции иммунитета хозяина, однако соответствующий механизм до недавнего времени оставался неизвестным. В работе, представленной коллективом исследователей из Северо-Западного Университета (США) под руководством Wyndham W. Lathem, показано, что одним из субстратов Pla является Fas-лиганд (FasL) – трансмембранный белок, локализованный на поверхности лимфоцитов. Этот белок, связываясь своим внеклеточным доменом с соответствующим рецептором (FasR) на поверхности другой клетки, запускает в ней процесс апоптоза через активацию каспазы-8 и затем каспазы-3/7. При контакте бактерии с клеткой, имеющей на поверхности FasL, протеаза Pla, локализованная на поверхности бактериальной клетки, катализирует расщепление внеклеточного домена FasL и инактивирует этот белок. Таким образом, патоген предотвращает апоптоз в клетках хозяина и ингибирует связанные с апоптозом воспалительные реакции, необходимые для полноценного иммунного ответа. Это, в свою очередь, повышает вирулентность патогена и способствует его выживанию в организме хозяина.

Эксперименты на мышах с легочной инфекцией показали, что бактерии дикого типа провоцировали снижение уровня FasL и активации каспазы-3/7, что в итоге приводило к быстрой колонизации легких патогеном, в то время как бактерии с инактивированной Pla размножались значительно медленнее. Продемонстрированный механизм подавления иммунного ответа, по мнению авторов, может использоваться и другими патогенами, в особенности вызывающими респираторные инфекции. Представленные данные в перспективе позволят разрабатывать специфические терапевтические подходы (например, использование ингибиторов Pla или экзогенного FasL), которые можно использовать для эффективного лечении инфекции в сочетании с классическими антимикробными препаратами.


Источник: Caulfield AJ, Walker ME, Gielda LM, Lathem WW. The Pla Protease of Yersinia pestis Degrades Fas Ligand to Manipulate Host Cell Death and Inflammation. Cell Host Microbe. 2014 Apr 9;15(4):424-34.

Подпись к рисунку: Графический абстракт к обсуждаемой статье.

---

Поблагодарили (7): vladimirchi, xenopus, Nasta, Goncharov, Vadim Sharov, NMR-guy, genseq

Синонимические или “молчащие” мутации изменяют нуклеотидные последовательности генов, но не аминокислотные последовательности кодируемых ими белков. Анализ данных по аномалиям структуры генома при раке, накопленных в последнее время, показывает возможную функциональную значимость молчащих мутаций. Они способны изменять экспрессию онкогенов и генов-супрессоров и влиять на процессы онкогенеза.

Геномы раковых клеток несут не только мутации, связанные с прогрессией опухоли, но и накапливают так называемые мутации-”пассажиры”. Считается, что ”пассажиры” не могут прямо влиять на фенотип опухоли. Обширные данные по секвенированию раковых геномов, полученные в последнее время, позволяют подойти к решению проблемы как отличить мутации-драйверы, участвющие в онкогенезе, от нейтральных “пассажиров”.

Синонимические или “молчащие” мутации (СМ) изменяют нуклеотидные последовательности генов, но не последовательности аминокислот в кодируемых ими белках. Однако, есть данные, что СМ могут влиять на скорость и точность трансляции мРНК, на ее сплайсинг и укладку, на некоторые другие процессы реализации генетической информации. Имеются также данные и предположения, что СМ могут быть связаны с патогенезом некоторых заболеваний.

Работа опубликована в разделе “Теории”. Авторы предположили, что СМ могут принимать участие в онкогенезе. Они проанализировали данные по структуре экзомов >3000 генов, связанных с раком, и >300 полных геномов раковых клеток различных типов. Гены, связанные с раком, могут мутировать по различным механизмам. Для онкогенов свойственны активирующие их миссенс-мутации – точечные замены аминокислот, амплификация и транслокация генов. В отличие от них гены-супрессоры обычно инактивируются вследствие локальных или протяженных делеций, мутаций, досрочно терминирующих трансляцию (образование стоп-кодонов, сдвиг рамки трансляции), или мутаций в интронах, блокирующих сплайсинг пре-мРНК. Авторы проанализировали 292.405 миссенс-мутаций и 123.193 СМ, найденные в экзомах 3.581 опухоли 11 различных типов рака. Онкогены оказались обогащены СМ. В генах-супрессорах их доля была существенно меньше. Частота мутаций в одних и тех же онкогенах различна в зависимости от ткани и типа рака. Так, онкогенные миссенс-мутации при меланоме часто происходят в гене BRAF, а при колоректальном раке – в KRAS. Оказалось, что частота СМ в онкогенах имеет ту же тенденцию. В случае генов-супрессоров такой тенденции не наблюдалось. СМ могут быть локализованы в определенных участках генов. Так, в онкогенах, усиление активности которых связано с их амплификацией, СМ часто локализованы в 3'-нетранслируемой области.

Механизмы воздействия СМ на функцию гена могут быть различными. Не найдено указаний на то, что СМ могут влиять на оптимальное использование кодонов при трансляции, на вторичную структуру мРНК, на взаимодействие мРНК с микроРНК. Но СМ могут нарушать последовательности нуклеотидов в экзонах, которые влияют на эффективность сплайсинга. Такие СМ часто наблюдаются в гене онкосупрессора ТР53, в котором они нарушают правильный сплайсинг и таким образом инактивируют ген. Кроме того, СМ способны нарушать фолдинг белков, что также может быть связано с онкогенезом.

Подходы, примененные авторами, могут быть полезны для идентификации новых классов онкогенных мутаций и более полного понимания того, как изменения в геноме при раке влияют на прогрессию опухолей у индивидуальных пациентов.


Источник: Supek F, Miñana B, Valcárcel J, Gabaldón T, Lehner B. Synonymous mutations frequently act as driver mutations in human cancers. // Cell. 2014; V. 156: P. 1324-1335.

Подпись к рисунку: Оценка доли потенциальных драйверов рака среди синонимических мутаций.

---

Поблагодарили (7): inview, Newsline, Агроном, spqr, Lanik, Nasta, Vadim Sharov

Сальмонеллы – грамотрицательные бактерии, факультативные внутриклеточные патогены человека и животных. Вызываемый ими сальмонеллез согласно оценке ВОЗ является одной из часто встречающихся и широко распространенных болезней пищевого происхождения. Многие штаммы Salmonella устойчивы к целому ряду противомикробных препаратов и в настоящее время представляют серьезную проблему для здравоохранения.

Попадая в организм человека, сальмонеллы инфицируют макрофаги, размножаясь в вакуолях (фагосомах), в которых бактерии остаются невидимыми для иммунной системы и получают возможность распространяться по организму. Макрофаги, однако, обладают защитным механизмом, эффективным против внутриклеточных патогенов, включая сальмонеллы. Некоторые детали функционирования этого механизма были расшифрованы группой исследователей из Университета Базеля (руководитель – Petr Broz) и опубликованы в свежем выпуске Nature.

Используя методы экспрессионной протеомики для обнаружения белков, индуцируемых в результате заражения макрофагов сальмонеллой, авторы идентифицировали семейство интерферон-индуцируемых малых ГТФаз – гуанилат-связывающих белков (guanylate-binding proteins, GBPs). Продемонстрировано, что эти белки связываются с внутриклеточным патогеном и запускают процесс лизиса вакуоли, содержащей бактерии. В результате бактерии попадают в цитозоль, где их липополисахариды (LPS) узнаются неизвестным пока внутриклеточным рецептором, активирующим инфламмасомы. Инфламмасомы представляют собой сложный белковый комплекс, характерный для миелоидных клеток и содержащий ряд каспаз, включая каспазу-11. Активация этой каспазы в итоге приводит к пироптозу – процессу запрограммированной клеточной смерти инфицированных клеток иммунной системы, морфологически и механически отличающемуся от апоптоза и стимулирующему воспалительные реакции. Ключевую роль в активации каспазы-11 играет белок GBP2, непосредственно участвующий в лизисе инфицированных вакуолей. Остальные члены семейства GBPs также могут быть вовлечены в этот процесс.

Распознавание продуктов лизиса вакуоли осуществляет специфический сенсор – белок галектин-8, который взаимодействует с белками-эффекторами аутофагии. В результате запускается процесс поглощения бактерий аутофагосомами. Авторы считают, что распознавание LPS и активация инфламмасом происходит раньше запуска аутофагии. При этом, в результате удаления бактерий снижается и содержание LPS в цитозоле, что в свою очередь снижает активацию каспазы-11. Возможно, аутофагия бактерий служит дополнительным механизмом, обеспечивающим элиминацию патогена уже после его предъявления иммунной системе и запуска соответствующих иммунных реакций. Выяснение механизмов координации процессов аутофагии и каспазозависимой клеточной смерти представляется актуальной задачей будущих исследований.

Источник: Meunier E, Dick MS, Dreier RF, Schürmann N, Broz DK, Warming S, Roose-Girma M, Bumann D, Kayagaki N, Takeda K, Yamamoto M, Broz P. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 2014 Apr 16.

Подпись к рисунку: Бактерии Salmonella серотипа Typhi, 3D-реконструкция на основе сканирующей электронной микроскопии. Источник иллюстрации – CDC / Melissa Brower.

---

Поблагодарили (8): inview, Erin, Vadim Sharov, vladimirchi, isotope, Replikant, Goncharov, Kase

С целью получить подробную характеристику молекулярных нарушений при раке мочевого пузыря проведен детальный анализ аномалий в 131 опухоли по сравнению с нормальными тканями. Выявлен ряд генов, мутации в которых ранее не связывали с данной формой рака или с раками вообще. Характерной особенностью оказались частые мутации в регуляторных генах хроматина. Определены гены и пути, которые могут стать потенциальными мишенями для противораковой терапии.

Уротелиальная карцинома мочевого пузыря (УТК) – распространенное онкологическое заболевание, причина смерти примерно 150.000 человек в год по всему миру. До сих пор нет специфических для этого заболевания лекарственных средств, направленных против определенных молекулярных мишеней. Члены The Cancer Genome Atlas Research Network получили и обобщили данные по молекулярным аномалиям в 131 случае УТК по сравнению с нормальной тканью мочевого пузыря или с ДНК из крови. Образцы опухолей для экспериментов подвергались строгому отбору.

В ДНК опухолей наблюдалось много аномалий – несколько меньше, чем при раке легких и меланоме, но больше чем при других исследованных раках. В среднем, в каждом случае обнаруживались 302 мутации в экзонах, 204 аномалии структуры хромосом, 22 перестройки хромосом. В 49% образцов наблюдались мутации ТР53, в 76% случаев его функция была инактивирована. Часто наблюдались инактивирующие мутации RB1 с существенно сниженным уровнем мРНК и как правило совместно с делециями CDKN2A. Часто встречались мутации PIK3CA (20%), сгруппированные в спиральном домене вблизи Е545.

Были идентифицированы 32 гена, мутации в которых ранее статистически достоверно не ассоциировались с УТК. Среди них наиболее частыми оказались мутации в MLL2 (27%), CDKN1A (14%), ERCC2 (12%), STAG2 (11%). Достоверных ассоциаций с иными формами рака мутаций в трех последних геноах и в шести других ранее не обнаруживалось.

Наблюдалось 2.529 структурных аберраций хромосом, из которых 1.153 представляли собой слияние генов. Среди аберраций было несколько повторяющихся транслокаций, которые могут быть связаны с патологией. С частотой 4-6% встречались вирусные геномы и транскрипты цитомегаловируса, вирусов полиомы ВК и папилломы 16. Цитомегаловирус обнаруживался в форме эписомы, а другие могли интегрироваться в гены и влиять на их экспрессию. В некоторых случаях вирусная инфекция может играть роль в патогенезе УТК. Секвенирование РНК включая микроРНК, анализ экспрессии белков позволили описать 4 подтипа экспрессии.

Проведенный анализ позволил идентифицировать потенциальные мишени для противораковой терапии 69% опухолей, включая 42% с возможными мишенями на пути фосфатидил-инозитол-3-ОН-киназа/AKT/mTOR и 45% опухолей с возможными мишенями на пути RTK/MAPK. Особо примечательным результатом исследования является тот факт, что регуляторные гены хроматина при УТК мутируют значительно чаще, чем при любом другом раке изученном к настоящему времени. Это может предоставить дополнительные возможности для разработки средств противораковой терапии.


Источник: Cancer Genome Atlas Research Network. .Comprehensive molecular characterization of urothelial bladder carcinoma // Nature. 2014; V. 507: P. 315-322.

Подпись к рисунку: Пути, которые могут нарушаться при раке мочевого пузыря. Представлены соматические мутации и изменение числа копий (CNA) в компонентах путей. Красным показаны активирующие нарушения, синим – инактивирующие. Проценты означают частоту активации или инактивации по крайней мере одного аллеля.

---

Поблагодарили (3): Newsline, Vadim Sharov, Groshik

Биолюминесценция известна для различных представителей животного (и не только) мира, в том числе для некоторых насекомых. Люцифераза из светляка Photinus pyralis широко используется в качестве репортерного гена в различных областях молекулярной биологии. Люциферазы насекомых гомологичны ацил-коА синтетазам жирных кислот (fatty acyl-CoA synthetases, ACSLs), которые считаются эволюционными предками люциферазы. Соответствующий гомолог есть и у несветящейся дрозофилы. В недавней статье в PNAS американские ученые показали, что этот белок обладает способностью к люминесценции.

Известно, что определенные мутации в люциферазе светлячка приводят к усилению люминесценции при использовании синтетических люциферинов, но снижают свечение при использовании природного D-люциферина. Это навело на мысль, что требования к люциферинам могут существенно отличаться у разных форм люцифераз, и, соответственно, у разных их гомологов. Следовательно, ACSLs могут обладать люциферазной активностью, хотя таковая и не обнаруживается при использовании D-люциферина. Для подтверждения этой гипотезы авторы использовали очищенную ACSL Дрозофилы (CG6178), и протестировали ее люциферазную активность в присутствии различных синтетических люциферинов. Один из люциферинов, CycLuc2, вызвал красное свечение (максимум эмиссии – 610 нм).

Интересно, что D-люциферин является конкурентным ингибитором для CycLuc2 – синтаза CG6178 связывает D-люциферин, но не способна катализировать его аденилирование. Свечение, вызываемое CG6178, оказалось более стабильным – оно отличается отсутствием "взрывной" (“burst”) фазы, характерной для обычной люциферазы (когда в течение первых нескольких секунд свечение резко возрастает, а затем переходит в более длительную стабильную фазу (“glow”phase)). Используя люциферин CycLuc2, авторы обнаружили люциферазную активность в т.н. шнейдеровских клетках дрозофилы, в которых CG6178 экспрессируется в норме. Применимость CG6178 в качестве люциферазы была протестирована на культуре клеток млекопитающих (CHO). ACSLs млекопитающих обнаруживают более низкую степень гомологии с люциферином светляка, и они оказались неспособны к люминесценции в присутствии CycLuc2. Однако, не исключено, что удачный подбор люциферина позволит обнаружить люциферазную активность и у млекопитающих.

Таким образом, появление люцифераз и биолюминесценции в ходе эволюции может быть проще, чем предполагалось ранее, и может быть обусловлено появлением подходящего субстрата при отсутствии серьезных мутаций в самих генах-предшественниках люцифераз. Селективность CG6178 в отношении CycLuc2 может быть использована в разработке новых субстрат-селективных люцифераз и соответствующих репортерных систем на их основе.

Источник: Mofford et al. Latent luciferase activity in the fruit fly revealed by a synthetic luciferin. PNAS 2014 111 (12) 4443-4448.

Картинка из обсуждаемой статьи:
A – реакция, катализируемая люциферазой из светляка
B – реакция, катализируемая ACSLs

P.S. В качестве дополнительного чтения можно предложить старую, но интересную популярную статью о биолюминесценции Ю.А.Лабаса (1933-2008), одного из идейных вдохновителей открытия и исследования флуоресцентных белков в России: Неразгаданная Дарвином Биолюминесценция. Журнал "Природа", № 2, 2003

---

Поблагодарили (6): Serpent, inview, vladimirchi, Vadim Sharov, Newsline, Atropos

УФ-облучение сформировавшихся меланом не влияет на развитие опухолей, но стимулирует образование отдаленных метастаз. Ответ на вызванное УФ воспаление катализирует взаимодействие клеток меланомы с клетками эндотелия сосудов, которое приводит к поникновению раковых клеток в кровоток и диссеменации. Блокирование механизмов этого взаимодействия может стать эффективной стратегией для подавления метастазирования.

УФ-облучение является твердо установленным этиологическим фактором развития злокачественной меланомы. Найдены инициирующие опухоли мутации, возникающие в меланоцитах под действием УФ. Но как микроокружение опухолей реагирует на УФ, как это влияет на патогенез меланомы пока изучено недостаточно.

Авторы предположили, что УФ может воздействовать на микроокружение меланомы стимулируя выживание, экспансию и диссеменацию опухоли. Эксперименты проводились на мышах HGF-CDK4(R24C), у которых вследствие усиленной экспрессии фактора роста гепатоцитов HGF нарушена регуляция сигнального пути рецепторной тирозинкиназы и нарушен контроль клеточного цикла вследствие наличия онкогенной мутации CDK4(R24C). Меланомы индуцировали обработкой кожи канцерогеном диметил-бензантраценом. Участки кожи, где образовались опухоли, многократно облучали УФ-дозами, вызывавшими эритему.

Неожиданно оказалось, что повторное УФ-облучение не влияло на развитие меланом кожи, но увеличивало количество метастаз в легких. У 4 из 20 облученных мышей наблюдалась экспансия меланомных клеток в эндотелий кровеносных сосудов кожи. Ранее было известно, что подобное наблюдается у каждого пятого человека больного меланомой и связано с развитием метастаз, с негативным прогнозом.

Показано, что наблюдавшийся эффект связан с мобилизацией и активацией нейтрофилов, инициированных организатором и регулятором транскрипции HMGB1, который секретируется поврежденными кератиноцитами. Воспалительный ответ на УФ стимулировал ангиогенез и способствовал миграции клеток меланомы к клеткам эндотелия. Таким образом, воспалительный ответ на УФ-облучение катализирует взаимодействие клеток меланомы с клетками эндотелия сосудов, которое приводит к поникновению клеток меланомы в кровоток. Этот ангиотропизм представляет собой до сих пор малоизученный механизм метастазирования способствующий диссеменации раковых клеток через кровоток.

Полученные результаты показывают, что воздействие на фенотипическую пластичность клеток меланомы в ответ на воспаление, на механизмы их взаимодействия с клетками эндотелия может стать эффективной стратегией для подавления метастазирования.


Источник: Bald T, Quast T, Landsberg J, Rogava M, Glodde N, Lopez-Ramos D, Kohlmeyer J, Riesenberg S, van den Boorn-Konijnenberg D, Hömig-Hölzel C, Reuten R, Schadow B, Weighardt H, Wenzel D, Helfrich I, Schadendorf D, Bloch W, Bianchi ME, Lugassy C, Barnhill RL, Koch M, Fleischmann BK, Förster I, Kastenmüller W, Kolanus W, Hцlzel M, Gaffal E, Tьting T. Ultraviolet-radiation-induced inflammation promotes angiotropism and metastasis in melanoma. // Nature. 2014; V. 507: P. 109-113.

Подпись к рисунку: Метастазы меланомы в легких мышей не облучавшихся УФ (вверху) и периодически облучавшихся (внизу).

---

Поблагодарили (1): Erin

Не так давно К. Вентер синтезировал искусственный бактериальный геном на основе генома микоплазмы. Сейчас полным ходом идут работы над созданием уже эукариотического генома.

В статье в Science сообщается о синтезе первой искусственной эукариотической хромосомы – 3 хромосомы S. cerevisiae. Jef Boeke (New York University Langone Medical Center) – один из главных руководителей этого амбициозного проекта (который назвали "Sc2.0"). Началась эта история в 2006г, когда Boeke в разговоре с Srinivasan Chandrasegaran (бывшим коллегой Boeke по Johns Hopkins University) в шутку предложил не просто модифицировать дрожжевой геном с помощью нуклеаз (как это делал Chandrasegaran), а сделать геном "с нуля". Однако коллеги восприняли эту шутку всерьез.

Они начали с короткого фрагмента – R-плеча 9й хромосомы (90 кб). Они вставили сайты рекомбинации LoxP почти у каждого гена, а также около теломер, центромеры и др. важных элементов. Активация соответствующей рекомбиназы (cre) приводит к делеции случайного фрагмента, что позволяет эффективно проводить нокауты. Авторы назвали такой подход SCRaMbLE (synthetic chromosome rearrangement and modification by loxP-mediated evolution). Кроме того, были введены специальные метки (PCR-tags) для последующего PCR-анализа. Были удалены мобильные элементы, значительная часть интронов и некодирующих последовательностей, а теломеры были заменены на более короткие синтетические. Гены тРНК являются "горячими точками" повреждения ДНК и часто служат причиной остановки репликации. Поэтому 275 генов тРНК были удалены и перенесены на искусственную "неохромосому". В дальнейшем планируется перенести их в одну из следующих искусственных хромосом.

Все стоп-кодоны TAG были заменены на TAA. Предполагается, что когда будут доделаны все синтетические хромосомы, число таких замен будет более 1000. Это позволит зарезервировать кодон TAG для искусственной аминокислоты. Все эти изменения были просчитаны с помощью специально разработанной компьютерной программы, чтобы они не интерферировали с остальной, пока еще природной, частью генома. Синтез 90 кб R-плеча 9й хромосомы занял 11 месяцев, еще несколько месяцев было потрачено на введение его в живые клетки. Это успешно было завершено в 2011г. Полученные дрожжи оказались жизнеспособны, система SCRaMbLE тоже работала отлично. Вдохновленные успехом, авторы взялись за синтез целой хромосомы. Для этого были привлечены студенты из Johns Hopkins University. За полтора года 49 студентов сумели синтезировать и собрать 272 871 нуклеотидов искусственной хромосомы (размер природной – 316 667 нуклеотидов). Дрожжи, получившие синтетическую хромосому вместо природной, также оказались вполне жизнеспособны – это было проверено на разных средах и в различных условиях.

Дальнейшая работа над проектом "Sc2.0" приобрела международный размах – на сегодняшний день в нем участвуют институты Америки, Англии, Китая, Австралии, Сингапура и Индии (см. рис). Заменить все хромосомы на искусственные предполагается в течение ближайших двух лет. В дальнейшем ученые будут изучать эволюцию синтетического генома, а также использовать искусственные дрожжи для различных биотехнологических задач и фундаментальных исследований. Например, Boeke планируют исследовать молекулярные механизмы синдрома Леша-Нихена путем введения соответствующих генов в геном Sc2.0.

Таким образом, в случае удачного завершения проекта, он может стать эпохальной вехой в развитии синтетической биологии.


Источники:
Обсуждаемая статья в Science: Annaluru et al. Total Synthesis of a Functional Designer Eukaryotic Chromosome. Science 4 April 2014:Vol. 344 no. 6179 pp. 55-58

News focus (Science): E. Pennisi. Building the Ultimate Yeast Genome. Science 28 March 2014: Vol. 343 no. 6178 pp. 1426-1429

См.также Nature News: E. Callaway. First synthetic yeast chromosome revealed.

Картинка из News focus (Science)

---

Поблагодарили (8): Cyril, Replikant, Lanik, campus, Agouti, Luferchik, Apachi, Atropos

Тройной негативный рак молочной железы (triple-negative breast cancer, TNBC) – наиболее агрессивная форма рака молочной железы, характеризующаяся отсутствием экспрессии в опухолевых клетках рецептора эстрогена, рецептора прогестерона и рецепторной тирозинкиназы HER2. Лечение данной формы представляет собой сложную задачу, так как мишенью для многих традиционных терапевтических агентов является один из упомянутых белков-рецепторов. Патогенез TNBC изучен довольно слабо; соответственно, для разработки новых эффективных терапевтических подходов необходима идентификация ключевых регуляторов этого процесса.

Один из таких ключевых регуляторов удалось обнаружить коллективу исследователей под руководством Laurie H. Glimcher из Weill Cornell Medical College. Опубликованная в Nature работа посвящена роли гена XBP1 в прогрессии TNBC. XBP1 кодирует транскрипционный фактор, участвующий в регуляции клеточного ответа на стресс. Механизм активации XBP1 связан с альтернативным сплайсингом соответствующей мРНК при участии эндонуклеазы IRE1α. Активация происходит в ответ на стресс, в результате начинает экспрессироваться функционально активная изоформа XBP1s. В нормальных условиях экспрессируется неактивная изоформа XBP1u.

Авторы обсуждаемой работы обнаружили высокий уровень активации XBP1 как в перевиваемых культурах клеток TNBC, так и в первичных культурах клеток пациентов. При этом XBP1 в условиях TNBC взаимодействует с транскрипционным фактором HIF1α и активирует HIF1α-зависимый метаболический путь, обеспечивающий адаптацию клеток к гипоксии и рост сосудов в ответ на снижение уровня кислорода. В результате повышается жизнеспособность опухоли, изначально испытывающей недостаток кислорода и питательных веществ вследствие недостаточной васкуляризации.

В экспериментах на клеточных культурах подавление активности гена XBP1 с помощью шпилечных РНК (shRNA) эффективно замедляло рост клеток. В случае использования модели ксенографтов TNBC у мышей супрессия XBP1 вызывала уменьшение размеров опухолей и снижала вероятность их рецидива и метастазирования. Данный эффект был значительно сильнее выражен в случае одновременного использования химиотерапевтичесих агентов – доксорубицина и паклитаксела. Таким образом, целенаправленное разрушение функциональной связи XBP1- HIF1α представляется очень перспективным с точки зрения терапии рассматриваемого рака, так как снижает жизнеспособность опухолей и делает их восприимчивыми к терапевтическим агентам.


Источник: Chen X, Iliopoulos D, Zhang Q, Tang Q, Greenblatt MB, Hatziapostolou M, Lim E, Tam WL, Ni M, Chen Y, Mai J, Shen H, Hu DZ, Adoro S, Hu B, Song M, Tan C, Landis MD, Ferrari M, Shin SJ, Brown M, Chang JC, Liu XS, Glimcher LH. XBP1 promotes triple-negative breast cancer by controlling the HIF1α pathway. Nature. 2014 Mar 23.

Подпись к рисунку: Схема взаимодействия XBP1 и HIF1α в условиях TNBC. Гипоксия индуцирует активацию XBP1, активированный XBP1 в свою очередь взаимодействует с HIF1α, что стимулирует экспрессию генов-мишеней HIF1, ответственных за прогрессию рака.
Рисунок из приложения к обсуждаемой статье.

---

Поблагодарили (5): Vadim Sharov, Wytalii, Lanik, Julchik, Агроном

При развитии эмбриона клетки альвеол АТ1 и АТ2 формируются из общего бипотентного предшественника. Но после рождения происходит переключение: обновление как АТ1, так и АТ2 осуществляют зрелые АТ2. Эта стволовоподобная функция АТ2 активируется при повреждении АТ1. Вероятно, активность АТ2 регулируется локальными сигналами: самообновление - через путь EGFR-KRAS, который также может быть использован при злокачественном перерождении клетки, а перепрогаммирование в АТ1 – через другой пока неустановленный путь.

Поверхность альвеол легких выстлана клетками двух типов: плоскими АТ1, осуществляющими газообмен и кубовидными АТ2, продуцирующими легочный сурфактант. Ранее считали, что клетки АТ1 происходят от АТ2, но в последнее время эта точка зрения пересматривается. До сих пор данные об альвеолярных стволовых клетках, предшественниках АТ1 и АТ2 были фрагментарны и противоречивы.

Авторы проследили на мышах пути формирования и функционирования АТ1 и АТ2 от эмбрионального состояния до зрелого организма. Анализ морфологии развивающихся альвеол в эмбриогенезе и на ранних стадиях постнатального развития с помощью 15 специфических маркеров АТ1 и АТ2 показал, что они происходят от единого бипотентного предшественника.

Обновление эпителия альвеол происходит довольно медленно и связано с пролиферацией ктеток АТ2. Прослеживание пролиферации и превращения клеток показало, что обновление происходит в отдельных локусах АТ2. В этих локусах обнаруживаются единичные подобные стволовым самообновляющиеся бипотентные АТ2, способные дифференцироваться как в зрелые АТ2, так и в АТ1.

Повышенная концентрация кислорода токсична для АТ1, но не АТ2. Показано, что при этом АТ2 активируются, некоторые из них приобретают свойства бипотентных для восполнения убыли АТ1.

Аденокарцинома – наиболее часто встречающаяся форма рака легких, связана с активирующими мутациями генов Kras или Egfr. Включение искусственно индуцируемого мутантного гена Kras(G12D), замещавшего у мышей нормальный, приводило к быстрому развитию опухолей и смерти животных через 20-60 дней после индукции. Через несколько дней после индукции наблюдалось резкое усиление пролиферации АТ2, но свойства бипотентных клеток они не приобретали и через некоторое время трансформировались в злокачественные.

Анализ профилей транскрипции в бипотентных предшественниках и АТ2 показал, что в них активно экспрессируются рецепторы семейства EGFR и рецепторы многих других сигнальных путей. Очищенные АТ2 сохраняли способность как к пролиферации, так и к дифференцировке в АТ1-подрбные клетки. Обработка лигандами EGFR стмулировала пролиферацию, но не дифференцировку.

Таким образом показано, что в эмбриогенезе АТ1 и АТ2 формируются независимо из общего предшественника. Через несколько недель после рождения формирование альвеол заканчивается и происходит переключение: некоторые зрелые АТ2 приобретают свойства бипотентных клеток и становятся предшественниками как АТ2, так и АТ1. Дополнительное количество АТ2 переходит в бипотентное состояние при повреждении АТ1. Онкогенный потенциал АТ2 вероятно является следствием стволовоподобных свойств, что позволяет отнести их к самым потенциально опасным клеткам организма. Гибнущие АТ1 вероятно секретируют EGF, стимулирующий АТ2, а для перепрограммирования в АТ1 требуется другие сигналы. Представляется очень важным установить эти сигналы и механизмы их контроля. Это позволит разработать новые стратегии для раннего обнаружения и лечения опухолей.


Источник: Desai TJ, Brownfield DG, Krasnow MA. Alveolar progenitor and stem cells in lung development, renewal and cancer. // Nature. 2014; V. 507: P. 190-194.

Подпись к рисунку: Модель функционирования стволовых клеток и предшественников в альвеолах при их формировании, обновлении и при раке.
Бипотентный предшественник, экспрессирующий маркеры как АТ1 (зеленые), так и АТ2 (красные) дифференцируется в АТ1 или в АТ2. Зрелые АТ2 могут функционировать как столовые клетки для обновления альвеол или для репарации повреждений. Погибающие АТ1 дают сигнал (S1), передающийся по пути EGFR-KRAS, который активирует близлежащие АТ2 (самообновление), другой сигнал (S2) индуцирует перепрограммирование дочерних клеток в АТ1. Активирующие мутации Egfr или Kras в АТ2 вызывают их конститутивную дупликацию и формирование опухолей.

---

Поблагодарили (3): inview, Vadim Sharov, NMR-guy