Максипреп - лизис щелочью


MolBiol.ru > Методы > Плазмиды > Максипреп - лизис щелочью

ГЛАВНАЯ · БИОХИМИЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · ТУРИЗМ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · ·

ZBIO

Синтол · Millipore · Диаэм · Axygen · ДНК-синтез · БиоЛайн · Beckman Coulter · Хеликон · Химмед · Биосан · Merck KGaA · Waters · Elite-Genetix

ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · ILLUMINA SEQUENCING · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ИСТОРИЯ ЗООМУЗЕЯ · ИЗДАТЕЛЬСТВО КМК

Выделение pDNA (максипреп - лизис щелочью)

Дополнить

Лучший метод для получения pDNA высокого качества (годится даже для трансфекции). Его преимущества:
- очень низкая цена,
- высокая скорость.

растить ночную культуру 20-24 часа в 100-500ml богатой среды: 37^oС, 200-300rpm;
ЦФ 4^oС, 10-15', слить среду;
ЦФ 4krpm, 1', отсосать остатки жидкости;
ресуспензировать в 10(5)ml раствора "I";
+ 1(0.5)ml свежеприготовленного раствора лизоцима (10mg/ml в р-ре "I");
NT, 15';
+ 20(10)ml раствора "II", вылить резко, смешать:

0^oС, 5';
+ 10(5)ml холодного 10М AcONH₄ (добавлять 5 ml пипеткой по каплям), смешать;
0^oС, 5';
ЦФ 5krpm, 4^oС, 10';
супер снять, разделить на 2 пробирки, добавить к каждой по 12.5 ml изопропанола. Делать это на весах, чтобы пробирки имели равный вес;
NT, 10';
ЦФ 5krpm, 4^oС, 10', сбросить супер;
ЦФ NT, 3', отсосать остатки жидкости (не подсушивать);
cуспендировать осадок в 800µl 2 M AcONH₄, объединить в одной 2ml пробирке;
NT, 5';
ЦФ NT, 10';
cупер перенести в пробирку с 800µl изопропанола;
NT, 5';
ЦФ NT, 5';
сполоснуть 70% EtOH;
растворить в 0.2-1ml H₂0.

MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 9885

Комментарии

Смотри комментарии к 04_01 Выделение pDNA (минипреп).

Дополнение от человека знающего (но неизвестного):

Я обнаружил, что если добавить к раствору II Triton X-100 до конечной концентрации 0.2%, осадок становится устойчивее и геномная ДНК высаживается полнее. Это не рекомендуется делать при очистке больших космид.
Чтобы получить более чистую плазмиду полезно перед осаждением изопропанолом профильтровать лизат через фильтровальную бумагу или Miracloth (Calbiochem).

Дополнения, комментарии, вопросы

Люди знающие! Здесь недостаёт того, что знаете вы, но не знал или забыл автор. Этой страницей пользуются ваши коллеги. Пожалуйста, поделитесь с ними опытом. Пригодится всё, что поможет в работе.

Гость /25.08.2006 09:13/

A [NT] eto [Normal Temperature]?

Redactor /25.08.2006 10:24/

да

Гость /19.09.2006 11:42/

Раствор 1 (с лизоцимом) в случае колей можно не применять. Они со свистом лизируются в р-ре 2.

Гость /15.09.2008 15:26/

Скажите, пожалуйста, можно ли на конечной стадии прогреть плазмиду 90 град минут 5? Осадок почему-то не растворился почти и более низкотемпературный прогрев не помогает...

pacak /27.10.2008 00:49/

Здравствуйте,
Вам может покозаться странным но у нас в лаб. нет амония ацетата, можно ли применят для высаживания ДНК в данном протоколе ацетаты калия или натрия? Надо ли изменить пропорцию соли в растворе для калия и натрия ?
Спасибо.
пацак

guest: ммм /31.10.2008 16:14/

--можно ли применят для высаживания ДНК в данном протоколе ацетаты калия или натрия.
Калия и Натрия можно, лучше калия см Маниатиса. Стандарт для любой ДНК и спирта 0.3М раствор.

Для третьего раствора бывают вариации с рН. и Соотношением объемов.

guest: Глеб /06.11.2008 14:30/

>Скажите, пожалуйста, можно ли на конечной стадии прогреть плазмиду 90 град минут 5?

Нет, плазмиде настанет п-ц. Проверено. Была та же проблема, решилась включением промежуточной стадии - очистка хлороформом перед тем как спирт добавлять. Т.к. ваш осадок скорее всего содержит массу всякой шняги, вот и не растворяется.

>можно ли применят для высаживания ДНК в данном протоколе ацетаты калия или натрия? Надо ли изменить пропорцию соли в растворе для калия и натрия ?

Можно, так и делаем.

polymerase /19.03.2009 17:35/

При какой температуре нужно хранить выделенную pDNA, элюированную водой?

guest: mlog /22.03.2009 22:50/

Годится ли этот метод для выделения низкокопийных плазмид?

guest: ммм /24.03.2009 19:25/

--Годится ли этот метод для выделения низкокопийных плазмид?

Да! Но! Нужно брать много культуру 300-1000мл. Очень высокая примесь РНК. Поэтому нужно РНКазить мощнее чем обычно.

--- страница форума с комментариями --

Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/

-- как прислать био-картинку --

Дата последней модификации: 25/08/06

ZBIO

Синтол · Millipore · Диаэм · Axygen · ДНК-синтез · БиоЛайн · Beckman Coulter · Хеликон · Химмед · Биосан · Merck KGaA · Waters · Elite-Genetix

ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · ILLUMINA SEQUENCING · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ИСТОРИЯ ЗООМУЗЕЯ · ИЗДАТЕЛЬСТВО КМК

· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · PlastMarket - продажа комплектующих для производства окон в Украине ·

--- сервер арендован в компании euhoster.ru, Финляндия, г.Хельсинки ---

· Slando - объявления о работе в Киеве и Киевской области · Купить bluetooth гарнитуру на SotMarket.ru · Купить аксессуары для ноутбуков и нетбуков оптом в интернет-магазине Либерти

--- администрирование сервера: Intervipnet ---

· Сландо - работа в Москве: огромная база вакансий и резюме · отличный выбор ванны чугунные с доставкой · недорогие межкомнатные двери в интернет-магазине ·

molbiol.ru · redactor@molbiol.ru · реклама