Буфер с высокой ионной силой применяется для нитроцеллюлозных и нейтральных или отрицательно заряженных нейлоновых мембран. Для переноса на положительно заряженные нейлоновые мембраны (такие как HybondN+) можно использовать щелочной перенос, при котором фиксация DNA на мембране происходит одновременно с переносом (Перенос по Southern (щелочной).).
зарисовать маркер;
отрезать 1/2 маркера, лишний гель, лунки, правый верхний угол геля;
измерить и записать размер геля;
качать в 0.25M HCl (+ 10' после того, как пожелтеет бромфеноловый синий);
сполоснуть H2O;
мягко качать в денатурирующем буфере (+ 15' после того, как бромфеноловый синий поменяет цвет) ~20';
мягко качать в нейтрализующем буфере (+ 15' после того, как бромфеноловый синий поменяет цвет) ~20';
в это время подготовить:
* 3 куска ватмана 3MM по размеру геля;
* 2 больших куска ватмана 3MM - на подложку;
* мембрану Hybond N+ (размер геля +3-5mm c каждой стороны);
* 4 ленты парафильма;
* стопку фильтровалки;
поочередно обмакнуть в 20x SSC большие куски ватмана и положить их на подложку без пузырей, опустить концы в 20x SSC;
положить гель дном вверх (без пузырей), налить сверху немного 20x SSC;
подложить рядом ленты парафильма так, чтобы мембрана не соприкоснулась с 3MM когда гель сожмется;
мембрану смочить в 20x SSC, положить на гель (без пузырей);
сверху - 3 куска ватмана 3MM (нижний перед укладкой смочить в 20x SSC), стопку фильтровалки, плоскую пластину и грузик (~300g для 10x10cm2геля);
перенос в 20x SSC 2-16h;
зарисовать на мембране карандашом границы геля;
подписать мембрану;
прополоскать ~5' в 2хSSC;
срезать ненужные участки;
фиксировать DNA ультрафиолетом UV=120mJ/cm2
завернуть в Saran Wrap, хранить при NT или при -20oС.
SSC - не единственный возможный буфер для переноса. Было показано, что даже более хорошие результаты дает использование:
* NH4Ac 1M, NaP (pH 6.5) 25mM
* или NH4Cl 1M, NaP (pH 6.5) 25mM
Есть сообщение, что присутствие Mg2+ ингибирует связывание DNA с мембраной при dot-blottinge (даже при ~ 1mM). Добавление EDTA до 100 mM перед денатурацией восстанавливает связывающую способность даже для 6mM MgCl2.
По пунктам
п. 4.
Апуринизация приводит к умеренному дроблению DNA (фрагменты большого размера (>5kbp) плохо проходят сквозь агарозу при переносе). Важно не превышать указанное время.
п. 9.
Очень удобно, когда подложка имеет размер геля. В этом случае нет нужды прокладывать парафильм в п. 10.
п. 10.
Чтобы положить гель без пузырей надо налить на подложку немного буфера для переноса.
п. 12.
Мембраны плохо (долго) смачиваются в растворах с высокой ионной силой. Если хочется сделать это побыстрее, то лучше смочить мембрану в mQ, а затем ополоснуть в 20xSSC.
п. 19.
Практически во всех руководствах пишется, что зафиксировать DNA на нитроцеллюлозной мембране можно лишь запеканием в вакууме 80oС, ~2h (кстати, для этого удобно использовать гель-драер; нейлоновые мембраны тоже можно фиксировать "запеканием", но для них вакуум не обязателен). Тем не менее мы беспроблемно фиксировали DNA на нитроцеллюлозе ультрафиолетом.
Можно запечь мембрану в микроволновой печи ~2.5 min при W~750-900W (нет переэкспозиции, если и в 2 раза дольше).
MolBiol.ru >
Методы >
Электрофорез > Саузерн (перенос в SSC)
Zbio-wiki
Дополнить
Есть сообщение, что присутствие Mg2+ ингибирует связывание DNA с мембраной при dot-blottinge (даже при ~ 1mM). Добавление EDTA до 100 mM перед денатурацией восстанавливает связывающую способность даже для 6mM MgCl2.