С помощью DEAE-целлюлозы


MolBiol.ru > Методы > ДНК из геля > С помощью DEAE-целлюлозы

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · ·

Zbio-wiki

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ИСТОРИЯ ЗООМУЗЕЯ

Выделение ДНК из агарозного геля с помощью DEAE-целлюлозы

Растворы

LSB
HSB
EDTA 10mM
NaOH

Комментарии

Общие
По пунктам

Дополнить

Метод дёшев, удобен тем, что можно одновременно элюировать очень много полосок (хоть весь гель - электроблоттингом).

провести форез в геле с 0.5µg/ml EtBr;
сделать разрез перед полосой под длинноволновым UV (360 nm);
вырезать DEAE-мембрану на 2mm шире полосы DNA, обработать:

5' в 10mM EDTA (pH 8.0),

5' в 0.5N NaOH,

как следует отмыть в mQ,

перед использованием сполоснуть в 1xТАЕ;

тупым пинцетом вставить мембрану перед полосой;
вогнать DNA в мембрану;
сполоснуть мембрану в LSB;
поместить её в 0.5ml пробирку, + HSB, чтобы полностью покрыть мембрану;
65^oС, 15';
проткнуть пробирку, вставить в 1.7ml пробирку, ЦФ 1';
проконтролировать, что DNA не осталась на DEAE целлюлозе (UV, 360nm);
экстрагировать Ф:Х, Х;
+ 2V EtOH;
осадить;
сполоснуть 70% EtOH.
растворить в воде или TE.

MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 16954

Комментарии

Общие

Принцип метода: отрицательно заряженная DNA адсорбируется на положительно заряженный DEAE ионообменник в низкосолевом буфере и снимается с него в высокосолевом буфере при повышенной температуре.
Метод нельзя использовать для выделения одноцепочечной DNA - плохо снимается.
Эффективно выделяются фрагменты длиной <5kbp, метод непригоден для выделения фрагментов > 15kbp.

По пунктам

п. 2.

Коротковолновое UV- облучение (254nm) может очень сильно понизить эффективность трансформации (365nm облучение сказывается слабо). "Вредоносность" 254nm облучения зависит от размера pDNA. 1' облучения уменьшает эффективность клонирования pDNA в:

3.2kb	~ 4 раза
4.8kb	~ 30 раз
8.2kb	~ 500 раз

п. 6.

Мембрану можно хранить несколько недель в mQ.

п. 8.

Можно заморозить мембрану в жидком азоте и пока бумажка твердая воткнуть её в гель.

п. 11 - 13.

Элюция DNA с мембраны.

п. 13.

DNA можно хранить в HSB несколько дней при 4^oС или любое время при -70^oС.

Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/

-- как прислать био-картинку --

Дополнения, комментарии, вопросы

Люди знающие! Здесь недостаёт того, что знаете вы, но не знал или забыл автор. Этой страницей пользуются ваши коллеги. Пожалуйста, поделитесь с ними опытом. Пригодится всё, что поможет в работе.

Дата последней модификации: 30/07/13

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ИСТОРИЯ ЗООМУЗЕЯ

· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·

--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---

--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru · redactor@molbiol.ru · реклама