локализовать нужный бэнд по тени на бумаге (или на хроматографической пластинке DC Alufolien Kieselgel 60F254);
вырезать кусочек геля с бэндом и поместить его в 0.5ml пробирку с дырочкой во дне (эта 0.5ml пробирка вставлена в 1.5ml пробирку);
добавить к кусочку геля 50µl 2M LiClO4 и разбить гель в мелкую крошку центрифугированием из 0.5ml пробирки в 1.5ml пробирку (14000rpm 0,5мин.)
довести объём 2M LiClO4 до 350µl, элюировать олигонуклеотиды из крошенного геля при 60oC в течении 2 часов или в течении ночи на NT (лучше на шейкере);
отделить раствор от кусочков геля фильтрацией сквозь 0.45µm микроцентрифужный фильтр;
к супернатанту добавить 1ml ацетона и поместить на 1÷2 часа на -20oC;
осадить олигонуклеотиды ЦФ 14000rpm 30мин. при 4oC;
промыть осадок 200µl холодного ацетона, высушить при NT 15мин. и растворить в 15µl H2O;
определить концентрацию спектрофотометрически и хранить раствор при -20oC.
В наших руках метод нормально работал для 20÷120-нуклеотидных олигов.
В наших руках получалось, что переосаждение ацетоном давало более чистые олигонуклеотиды, чем очистка на обратнофазной колонке. Для лигазной детекции нам пришлось переделать партию олигонуклеотидов (обратнофазные были менее чувствительны).
По пунктам
п.2.
Белая бумага для принтера давала ту же чувствительность, что и хроматографическая пластинка. Дополнительное преимущество - можно использовать для каждого геля чистый лист.
Ультрафиолетовую лампу лучше расположить повыше и закрыть часть стекла картоном или пластиком так, чтобы оставшегося света едва хватало для локализации бэнда. Вырезать бэнды быстро. Всё это, чтобы не жечь олигонуклеотиды ультрафиолетом понапрасну.
Можно пользоваться сменным лезвием для скальпеля. Удобно иметь пакет с чистыми лезвиями, после вырезания сбрасывать лезвие в "грязное". Потом мыть и сушить сразу несколько лезвий.
Лучше сфотографировать гель до и после вырезания фрагмента. Можно использовать бытовой электронный фотоаппарат.
п.3.
Дырочку в пробирке можно сделать раскаленной иглой. Мы делали по две дырочки на пробирку со стороны "хвостика от обрезанной крышки", а при центрифугировании ориентировали пробирки "хвостиками наружу".
п.4.
Если вдруг после центрифугирования в верхней пробирке останется кусочек геля, можно вновь добавить 50µl 2M LiClO4 и центрифугировать ещё раз.
п.5.
Для ночной элюции можно оставить пробирки на бактериальной качалке.
Дополнения, комментарии, вопросы
Mks/08.11.2006 11:47/
Уважаемые коллеги! Поделитесь опытом очистки олигонуклеотидов на полиакриламидном геле.Как проводится методика(более детально).Буду признателен и если смогу чем нибудь помочь Вам-всегда рад! Green4enko@bigmir.net
Mks/30.11.2006 18:13/
У меня есть вопросы по пункту 6-8.
п.6 как отделить раствор от кусочков геля, если получается сплошная гелевая масса и настолько густая, что приходиться добавлять водный раствор лития перхлората больше 350 мкл, чтобы хоть что-нибудь отфильтровать. После фильтрации геля, часть его остается выше фильтра, а часть проходит сквозь фильтр, или же гелевая масса пролетает насквозь полностью.
п.7-8 при добавлении ацетона фильтрат соответственно становится твердым веществом. Как поступать дальше - осадок содержит кусок геля. В п.9 требуется промывать осадок холодным ацетоном, но это не приведет к очистке олигов от остатков геля.
Видимо, наша проблема заключается в фильтрации. Пробовали через наконечник пипетки с фильтром (предварительно измельчив и позамачивав).
К гелевой массе добавляем жидкости достаточно: на 2 г геля 350+ мкл.
Подскажите что мы делаем неправильно. Набили кучу шишек, а решения все невидно.
MolBiol.ru >
Методы >
Олигонуклеотиды > PAAG очистка
Zbio-wiki
Дополнить