Средний выход ~3µg на 100mg листьев (тот же результат получается на ките от Qiagen).
Так как ДНК не слишком много, то используются пробирки с одним silica-фильтриком диаметром 6mm. Емкость такой колонки должна быть ~ 6µg ДНК на колонку. Изготовление спин-колонки описано в протоколе Очистка pDNA на silica spin колонках.
По пунктам
п. 1.
Стеклянная крошка используется как наждак для растирания ткани.
Antifoam A: #10794 Fluka
В принципе, метод отлично работает и без Antifoam A (только пены побольше), даже наоборот, без Antifoam A меньше зеленого пигмента попадает на следующий шаг — с виду раствор чище.
п. 1-2.
В этих пунктах важно хорошенько растереть растительную ткань. Можно действовать, как описано здесь, а можно использовать какие-то другие способы гомогенизации (с помощью стальных шариков или др.).
п. 2.
Либо использовать фабричный пластиковый пестик, либо сделать пестик самому из легкоплавкого пластика (мы пробовали из одноразовых шпателей для растирания бактерий): пластик разогревается до размягчения и с силой вдавливается в пробирку.
п. 3.
В принципе, RNaseA не слишком охотно работает в SDS-содержащем буфере. Но здесь её добавляется так много, что она вполне справляется (заранее добавлять не надо!).
п. 5.
Можно обойтись и без хлороформа, но с ним супер существенно чище и не требуется проводить дополнительное ЦФ в п.9.
п. 11.
Наверное, можно грузить под вакуумом, но мы не пробовали.
п. 12.
WB может быть без одновалентной соли или содержать NaCl или KCl — результаты одинаковые.
п. 15.
При элюции в 10, 20, 40, 80µl сходит одинаковое количество ДНК (вполне возможно, что можно использовать менее 10µl).