с помощью препаровальных иголок перенести железы в новую каплю на чистое предметное стекло, подписанное алмазом;
накрыть покровным стеклом и вращательным движением расправить хромосомы;
фильтровалкой убрать избыток уксусной кислоты;
поместить стекло в камеру с жидким азотом, ~20';
сколоть покровное стекло толстым лезвием;
препарат "провести по спиртам" в 50 ml стаканах (до 100 стёкол без смены растворов):
70% EtOH, окунуть 3-4 раза;
96% EtOH, 5';
96% EtOH, 5';
сушить на воздухе, ~10';
препараты можно хранить в холодильнике (+4oС) до 6 месяцев.
Приготовление зонда
приготовить зонд, используя [H3] dNTP’s, (можно брать сразу несколько меченых букв);
после чистки на spin-колонке дополнительно чистить Ф:Х, Х;
определить активность синтезированного зонда на ФЭУ-счётчике;
добавить
NaCl 5M => 1/25V,
EtOH (96%) => 2.5V,
осадить, промыть 70% EtOH, высушить;
растворить в гибридизационном буфере из расчёта 105cpm/µl (можно хранить более года при -20oС)
Подготовка препаратов к гибридизации
просмотреть препараты под микроскопом, обвести участки с хорошо расправленными хромосомами алмазным маркером, пронумеровать стекла, отметить не самые удачные препараты (их используют как контроль и проявляют в первую очередь);
инкубировать препараты в 2хSSC 65-70oС, 30';
"провести по спиртам" (до 30 стёкол без смены растворов):
50ml стаканы
70% EtOH, окунуть 3-4 раза;
70% EtOH, окунуть 3-4 раза;
100ml стеклоприёмники
70% EtOH, накопить стёкла после (I) и (II);
96% EtOH, 15';
96% EtOH, 15';
подсушить на комнатной температуре, 10-15';
денатурировать хромосомы 1' в 0.07N NaOH (приготовить свежий из 0.7N NaOH стока);
"провести по спиртам" (см. п.19.). Спирты после этого вылить.
Гибридизация
гибридизационную смесь с зондом денатурировать 65oС, 20', сразу в лед на 2';
наносить 1-2µl на пятно ( в зависимости от размера пятна);
наложить покровное стекло (следить, чтобы оно легло без пузырей). Замотать парафильмом, гибридизовать при 37oС 14-16h во влажной камере (фильтровальная бумага смоченная 2хSSC).
Отмывка
отмывать 3-4 раза в 50ml 2xSSC, 37oС, по 30';
"провести по спиртам" (см. п.19);
уложить в коробочку, переписать порядок препаратов;
Авторадиография
приготовить для работы в тёмной комнате:
для расплавления эмульсии - водяную баню на 50oС;
фильтровальную бумагу;
колодку (подставку), вокруг которой будут сушиться стекла;
кусочки парафильма, чтобы замотать эмульсию;
коробку с препаратами;
черную фотобумагу (завернуть коробку);
резинки (замотать коробку);
фольгу (завернуть эмульсию, если старая фольга порвется);
окунуть препарат в эмульсию нагретую до 45-50oС на 20-30'';
выставить на фильтровалку рядом с колодкой эмульсией вниз, высушить при NT 10-15';
сложить препараты в коробочку, отделив контрольные препараты;
записать с какой стороны эмульсия, завернуть в черную бумагу;
экспонировать от 3х суток и более (время экспозиции подобрать, проявляя контрольные препараты).
Для приготовления препаратов политенных хромосом используют слюнные железы личинок III возраста. Чтобы получить высокую политению, личинки должны расти при нормальной плотности (чтобы корм был хорошо разработан, но не было перенаселения), желательно при 16oС.
Следует отметить, что степень политении сильно зависит от погоды. Плохие приметы - смена погоды, изменения в течение для температуры или давления, дождливая или жаркая погода. Если "пошли плохие препараты", такие ухищрения как изменения температуры роста личинок и корма практически, не помогают. Лучшее решение проблемы - прекратить работу и попробовать снова через некоторое время.
п. 5.
Это требует опыта. Слишком слабое нажатие - хромосомы плохо расправляются. Слишком сильное - хромосомы "перетягиваются" (толщина неравномерна по длине хромосомы, плохо различаются бэнды, после гибридизации будет затруднена локализация). Сложно объяснить с какой силой надо расправлять препараты: это надо почувствовать методом проб и ошибок.
п. 7.
Замораживание-скалывание прилепляет хромосомы к стеклу.
п. 9.
При проводке по спиртам хромосомы отмываются от уксусной кислоты и фиксируются на стекле.
Стоит рассчитать оптимальное соотношение меченые трифосфаты/матрица, т.к. удельная активность [H3]-меченных нуклеотидов сильно отличается от [P32]-меченных. Слепое перенесение того, что вы делали с [P32] на [H3] опасно.
п. 14.
Вода - сильный тушитель, поэтому фильтры должны погружаться в сцинтиляционные флаконы совершенно сухими.
Для определения % включения необходимо использовать два GFC-фильтра, на которые нанесено одно и то же количество реакционного раствора. Мы поступаем следующим образом:
обмакнуть желтый тип в реакцию, и то, что прилипло к стенкам, перенести в ~2µl H2O;
уже из этой капельки перенести равные 0.5µl объемы на два фильтра;
контрольный фильтрик - сушить либо под "ветерком" ~3', либо в термостате 65oС ~5';
второй фильтрик - после промывки 10% ТХУ дополнительно сполоснуть 96% EtOH, наколоть на иглу, сушить либо под "ветерком" ~5', либо в термостате 65oС ~7-10';
поместить фильтрики в 1-5ml cцинтилляционного раствора.
Фильтрик, отмытый ТХУ, слабо загрязняет cцинтилляционного раствор. Поэтому раствор можно использовать вновь после извлечения фильтрика.
п. 24.
Покровные стекла нарезать алмазом ~ по размерам пятен с хромосомами, окунуть в спирт, пронести над пламенем спиртовки и хранить в специальной посуде (например, в маленькой чашке Петри, на дне которой лежит черная бумага).
п. 30.
Покрывать препараты эмульсией и складывать в коробку в той же последовательности, в какой они были переписаны. Это особенно важно, когда ставится гибридизация с несколькими зондами.
п. 34.
Если появится сильный фон - проявлять все препараты вне зависимости от силы сигнала.
п. 35.
Для проявления 1-2 контрольных препаратов использовать стаканчик. Если препаратов много - стеклоприёмник.
MolBiol.ru >
Методы >
Иммуногисто.. > Гибридизация на политенных хромосомах
Zbio-wiki
Дополнить