Однокомпонентні розчини

Про перерахунок рецептів на довільний об'єм:

Органічні речовини

Температурна залежність рН для поширених буферів

Буфер: pKa/20oC delta pKa/10oC MES 6.15 -0.110 ADA 6.60 -0.110 PIPES 6.80 -0.085 ACES 6.90 -0.200 BES 7.15 -0.160 MOPS 7.20 -0.013 TES 7.50 -0.200 HEPES 7.55 -0.140 Трицин 8.15 -0.210 Tris 8.30 -0.310 Біцин 8.35 -0.180 Гліцилгліцин 8.40 -0.280




ATФ

C₁₀H₁₄N₅O₁₃P₃Na₂ Mw=551.1 g/M; (зберігати при -20^oC).

Конц. Stock 1ml ATФ 0.1M 551.1g/M 55.1mg H2O   mQ

0.1M ATФ (pH 7.2): 5.71% (w/w) ATФ, 84.86% (w/w) H₂O, 9.43% (w/w) 2M Tris основа.

довести до рН7,5 додаванням 2М NaOH (~70-80µl);

приготувати близько 700µl, розвести у 2000 разів (це є кінцеве розведення у спектрофотометричній кюветі), перевірити оптичну густину:

c[M]=A₂₅₉/15.4x10³=A_{259 1:2000}x0.130; потім довести до кінцевого об'єму.




Бетаїн

моногідрат C₅H₁₁NO₂xH₂O; Mw=135.2g/M; (зберігати при 4^oC).

Конц. Stock %(w/w) 100ml 200ml 700ml Бетаїн 135.2g/M 5M 63.00 67.6g 135.2g 473.2g H2O   mQ 37.00 39.74ml 79.49ml 278.2ml

p~1.073g/ml




Крезол червоний

50mM (зберігати при +4, -20^oC):

Конц. Stock 1ml 50ml Крезол червоний 50mM 404.4g/M 20.2mg 1.01g H2O   mQ

Крезол Червоний - дуже зручний барвник. При концентрації близько 0,2мМ він сумісний з гідролізом рестриктазами, ПЛР, секвенуванням. Його можна використовувати як маркер для електрофорезу.

колір барвнику залежить від рН (червоний, коли рН>7,5; жовтий, коли pH <7,5). Можна використовувати Крезол Червоний як індикатор рН (1) для денатурації дволанцюгової ДНК при секвенуванні, (2) для очищення ДНК з агарозного гелю.




DTT

C₄H₁₀O₂S₂ Mw=154.2g/M; (зберігати при -20^oC).

Конц. Stock %(w/w) 1ml 5ml 10ml 20ml DTT 154.2g/M 1M 14.55 0.155g 0.773g 1.55g 3.09g H2O   mQ 85.45 905 µl 4.53ml 9.05ml 18ml

p~1.06g/ml

Конц. Stock 1ml 5ml 10ml 20ml DTT 154.2g/M 2.2M 0.339g 1.696g 3.394g 6.787g H2O   mQ

стерилізація через фільтр;

не обробляти ДЕПК;

ми не знаємо, чому, але багато посібників (можливо, за "Маніатісом") рекомендують готувати DTT у 10мМ ацетаті натрію, рН 5,2.





Приготування суміші dNTP

Швидкий протокол для ~100mM концентрованого розчину.

1. розчинити усі чотири dNTP (250mg кожного) у 3.676ml H₂O;
2. + 424µl 5M NaOH;
3. перевірити рН: ~0.5µl на pH-папері.




Звичайний (точний) протокол для приготування 100mM концентрованих розчинів.

1. додати необхідну кількість (див. таблицю) H₂O та Tris основи 1M (можна прийняти об'єм розчину ~150µl);

Mw V(H2O) V(Tris основи 1M) V(кінц) dATP C10H14N5O12P3Na2x3H2O 589.2 3.24ml 850 µl 4.24ml dGTP C10H13N5O13P3Na3x2H2O 609.2 3.55ml 400 µl 4.10ml dCTP C9H13N3O13P3Na3x2H2O 569.1 3.44ml 800 µl 4.39ml dTTP C10H14N2O14P3Na3x2H2O 584.1 3.73ml 400 µl 4.28ml

2. перевірити рН: ~0.5µl на pH-папері;
3. перевірити якість та концентрацію (корисно використовувати кінцеве розведення 1:5000 (~20µM). У цьому разі оптична густина буде близько A_m~0.3 - найточніша область спектрофотометру).
   Концентрація c[mM]=k_1:5000xA_m.

Якість:

dATP pH 7.0 A250/A260=0.80+0.03 A280/A260=0.12+0.02 dCTP pH 2.0(!) A250/A260=0.45+0.03 A280/A260=2.10+0.15 A290/A260=1.60+0.10 dGTP pH 7.5 A250/A260=1.18+0.04 A280/A260=0.67+0.03 A290/A260=0.28+0.03 dTTP pH 7.5 A250/A260=0.65+0.03 A280/A260=0.73+0.03

Концентрація:

Mw Am pH E k (for 1:5000) dATP[Na2] 589.2 259 7.0 15.2x103 328.9 dGTP[Na3] 609.2 253 7.5 13.7x103 365.0 dCTP[Na3] 569.1 280 2.0 (!!!) 13.0x103 384.6 dTTP[Na3] 584.1 267 7.5 9.6x103 520.8             ATP [Na4] 595.1 259   15.4x103   CTP [Na4] 571.1 280   13.0x103   GTP [Na4] 611.1 252   13.7x103   UTP [Na4] 572.1 262   10.2x103

Концентрація: c[M]=A_max/E; A_max = максимум поглинання.




EDTA

C₁₀H₁₄O₈N₂Na₂x2H₂O; Mw=372.3g/M; pH = 8.0 (зберігати при 4^oC).

Конц. Stock %(w/w) 50 ml 100 ml 150 ml 250 ml EDTA 0.5 M 372.3g/M 16.98 9.31g 18.62g 27.92g 46.55g NaOH ~0.5 M 40g/M 1.82 1.014g 2.028g 3.042g 5.07g H2O   mQ 81.19 44.48ml 88.95ml 133.4ml 222.4ml

Конц. Stock 10 ml 50 ml 100 ml 150 ml 250 ml EDTA 0.5 M 372.3g/M 1.86g 9.31g 18.62g 27.92g 46.55g NaOH ~0.5 M 10M 507µl 0.674g 2.535ml 3.37g 5.07ml 6.74g 7.61ml 10.11g 12.68ml 16.85g H2O   mQ 8.42ml 42.12ml 84.24ml 126.4ml 210.6ml

p~1.096g/ml

EDTA нерозчинна при кислих рН. Необхідно поступово додавати луг та контролювати рН.

не обробляти ДЕПК.




EtBr

Бромід етидію, C₂₁H₂₀N₃Br; Mw=394.3g/M; (зберігати при NT у темряві);

Конц. 5ml 10ml 50ml EtBr 10mg/ml 50mg 100mg 500mg

розчиняється у H₂O, EtOH, хлороформі;

що стосується канцерогенних властивостей EtBr. Єдині дані, що ми знайшли у літературі, стосуються тесту на мутагенність (на бактеріях) - 90µg дають такі самі результати, як концентрат диму однієї цигарки.




Желатин

(зберігати при 4^oC).

Конц. Stock 10ml 50ml 100ml Желатин 2% твердий 0.2g 1.0g 2.0g H2O   mQ

стерилізація автоклавуванням.




Глюкоза

C₆H₁₂O₆xH₂O, Mw=198.17g/M; 39.6%, p=1.13

Конц. Stock %(w/w) 200ml 500ml Глюкоза 2M 198.17g/M 35.07 79.27g 198.2g H2O   mQ 64.93 146.6g 366.5g




Гуанідин HCl

CH₅N₃xHCl, Mw=95.53g/M

Молярність   1 2 3 4 5 6 Гуанідин HCl (g/L) 95.53g/M 95.53 191.06 286.59 382.12 477.65 573.18 H2O (ml/L) mQ 924.2 854 783.7 711.7 639.8 567.2 Гуанідин Cl %(w/w)   9.37 18.28 26.78 34.93 42.75 50.26 H2O %(w/w)   90.63 81.72 73.22 65.07 57.25 49.74 p (g/ml)   1.020 1.045 1.070 1.094 1.117 1.140

розчинність: при 25^oC -> 8.54M, 5^oC->>8M;

A₂₆₀(6M у H₂O)<0.03;

при обчисленні розчинів можна прийняти "парціальну густину гуанідин HCl" рівною 0,763.




HEPES

Конц. Stock %(w/w) 1L C8H18N2O4S 1M 238.3g/M 22.40 238.3g H2O   mQ 77.60 825.7ml

p=1.064

HEPES, 1M, 1L

KOH, 5M [ml] pH 0 5.25 0.5 5.35 3.5 5.75 7 6.03 12 6.24 22 6.59 32 6.71 45 6.88 50 7.00 60 7.10 80 7.25 92.5 7.37




Імідазол

C₃H₄N₂, (зберігати при 4^oC):

Конц. Stock 50ml 100ml Імідазол 2M 68.1g/M 6.81g 13.62g H2O   mQ




Параформальдегід

PFA (параформальдегід) 37% (для гістохімії він повинен бути свіжеприготованим).

1. змішати у пробірці з пробкою, що загвинчується:

PFA (твердий) => 0.37g,
H₂O => 1.0ml
NaOH (1N) => 14µl;

2. розчинити, нагріваючи у окропі (нагрівати поки рН не зменшиться до ~7.0 =>~1-3').




PEG

H(OCH₂CH₂)_nOH; (зберігати при 4^oC).

Конц. %(w/w) 10ml 50ml 100ml 150ml 200ml PEG6000 40% 37.21 4.0g 20g 40g 60g 80g H2O mQ 62.79 6.75g 33.75g 67.5g 101.25g 135.0g

p=1.075.




PMSF

(зберігати при -20^oC)

Конц. Stock 20ml C7H7FO2S 100mM 174.2g/M 0.348g Ізопропанол     20ml




Ретиноєва кислота

(all trans-R.a., Tretinoin, чуттєва до світла, зберігати при -20^oC):

Конц. Stock 16.6ml C20H28O2 10mM 300.4g/M 50mg EtOH   >96% 16.6ml

концентрований розчин 10mM, 1mM робочий розчин у EtOH готується безпосередньо перед використанням (краще додати чистий EtOH до контрольних клітин).




Tris Cl

C₄H₁₁O₃N; Mw=121.1g/M; (зберігати при 4^oC).

Конц. Stock 50 ml 100 ml 150ml 200ml Tris-основа 1M 121.1g/M 6.06 12.11g 18.17g 24.22g H2O до кінцевої ваги   mQ 52.03g 104.06g 156.09g 208.12g

1M: p=1.0406

2M Tris основа: 22.90%(w/w) Tris основа, 77.10%(w/w) H₂O; p=1.058

не обробляти ДЕПК;

стерилізація автоклавуванням;

рН Тріс-буферів залежить від концентрації. Якщо узяти за початковий 50mM розчин:

pH(500mM) => + 0.05
pH(5mM) => - 0.05

рН знижується на 0,028 коли температура підіймається на 1^oC.




Температурна залежність рН для Tris Cl 50mM

рН при г/літр для 0.05 M 5°C 25°C 37°C Tris HCl Tris Base 7.55 7.00 6.70 7.28 0.47 7.66 7.10 6.80 7.13 0.57 7.76 7.20 6.91 7.02 0.67 7.89 7.30 7.02 6.85 0.80 7.97 7.40 7.12 6.61 0.97 8.07 7.50 7.22 6.35 1.18 8.18 7.60 7.30 6.06 1.39 8.26 7.70 7.40 5.72 1.66 8.37 7.80 7.52 5.32 1.97 8.48 7.90 7.62 4.88 2.30 8.58 8.00 7.71 4.44 2.65 8.68 8.10 7.80 4.02 2.97 8.78 8.20 7.91 3.54 3.34 8.88 8.30 8.01 3.07 3.70 8.98 8.40 8.10 2.64 4.03 9.09 8.50 8.22 2.21 4.36 9.18 8.60 8.31 1.83 4.65 9.28 8.70 8.42 1.50 4.90 9.36 8.80 8.51 1.23 5.13 9.47 8.90 8.62 0.96 5.32 9.56 9.00 8.70 0.76 5.47 9.67 9.10 8.79 0.69 5.53




TrisCl: 250ml 1M

V HCl V HCl pH   0 10.44   1 9.54   2 9.26   3 9.08   3.7 8.98 5ml   8.76 6ml   8.67   10 8.4 11ml   8.22   14 8.13 13.5ml   8.06 14ml   8.04 15ml   7.97   17 7.92 16.5ml   7.82 16.7ml   7.8 17ml   7.77 18.3ml   7.63 18.6ml   7.59   20 7.75   23 7.4




1M Tris HCl:

pH Trizma base %(w/w) Trizma HCl %(w/w) H2O %(w/w) 7.5 2.30 12.37 85.33 8.0 5.16 8.64 86.20 8.2 6.50 6.89 86.61 8.8 9.63 2.82 87.55 9.5 10.76 1.02 88.22




Трицин

C₆H₁₃NO₅, Mw=179.2g/M;(зберігати при 4^oC).

Конц. Stock 50ml Трицин 1M 179.2g/M 8.96g H2O   mQ

Для 50ml:

5N KOH pH 7.0ml 8.30 7.5ml 8.38 8.0ml 8.47 8.15ml 8.5 8.5ml 8.6 9.0ml 8.68 9.5ml 8.78 10.0 8.90




Триетаноламін

1M (зберігати при 4^oC):

Конц. Stock %(w/w) 50ml Триетаноламін 1M 149.19g/M 14.69 7.46g 6.66ml H2O   mQ 85.31 43.34ml




Сечовина

CH₄N₂O, Mw=60.06g/M;

Молярність   1 2 3 4 5 6 7 8 CH4N2O(g/L) 60.06g/M 60.06 120.12 180.18 240.24 300.30 360.36 420.42 480.48 H2O (ml/L) mQ 950.6 905.8 861.3 817.0 771.6 726.7 681.2 635.7 p (g/ml)   1.011 1.026 1.041 1.057 1.072 1.087 1.102 1.116 CH4N2O %(w/w)   5.94 11.71 17.30 22.72 28.02 33.15 38.16 43.05 H2O%(w/w)   94.06 88.29 82.70 77.28 71.98 66.85 61.84 59.95

розчинність: при 25^oC: 10.49M, 5^oC: ~8M;

A₂₆₀(6M in H₂O)<0.06;

При обчисленні розчинів можна прийняти "парціальну густину сечовини" рівною 0,763.





Кислоти та луги

Назва: Формула: Mw % (w/w) [M] g у 1L реч. p [g/ml] ml/L для 1M розч. Гідроксид натрію NaOH 40 50% 19.1 763 1.53 52.4 30.1% 10.0 400 1.329 100 Гідроксид калію KOH 56.1 50% 13.5 757 1.52 74.1 23.06% 5.0 280.6 1.217 200 Гідроксид амонію NH4OH 35.0 28% 14.8 251 0.89 67.6 Оцтова кислота, льодяна CH3COOH 60.1 99.5% 17.4 1045 1.05 57.5 Оцтова кислота 36% 6.27 376 1.05 159.5 Мурашина кислота HCOOH 46.0 90% 23.4 1080 1.20 42.7 Соляна кислота HCl 36.5 36% 11.6 424 1.18 86.2 Азотна кислота HNO3 63.0 71% 15.99 1008 1.42 62.5 Хлорна кислота HClO4 100.5 70% 11.65 1172 1.67 85.8 Фосфорна кислота H3PO4 98.0 85% 18.1 1445 1.71 55.2 Сірчана кислота H2SO4 89.1 96% 18.0 1766 1.84 55.6




NaOH

Mw=40g/M; (зберігати при NT).

Конц. Stock %(w/w) 50ml 200ml 300ml NaOH 10M 40g/M 69.90 20g 80g 120g H2O   mQ 30.1 46.45ml 185.8ml 278.7ml

10M: 30.10%; p=1.329.

Конц. Stock 50ml 150ml 200ml NaOH 1M 10M 5ml 6.645g 15ml 19.94g 20ml 26.58g H2O   mQ 45ml 135ml 180ml

для зберігання краще використовувати пластикові пляшки, бо луги частково розчиняють скло.




KOH

Mw=56.11g/M; (зберігати при NT).

Конц. Stock %(w/w) 10ml 50ml 100ml 150ml KOH 5M 56.11g/M 23.05 2.806g 14.03g 28.06g 42.08g H2O   mQ 76.95 9.363g 46.81g 93.63g 140.4g

5M: 23.06%; p=1.217.

для зберігання краще використовувати пластикові пляшки, бо луги частково розчиняють скло.




Трихлороцтова кислота

Трихлороцтова кислота,CCl₃CO₂H Mw=163.39, (зберігати при нормальній температурі, у витяжній шафі).

Конц. %(w/w) 5ml 10ml 25ml 50ml TXО 100% (w/v) 68.78 5.0g 10.0g 25.0g 50.0g H2O mQ 31.22 2.27ml 4.54ml 11.35ml 22.7ml




Детергенти

Саркозил

(зберігати при NT).

Конц. Stock 1ml 3ml 5ml 15ml 50ml Саркозил 10% 30% 0.333ml 0.342g 1.00ml 1.027g 1.67ml 1.712g 5.00ml 5.14g 16.67ml 17.12g H2O   mQ 0.667ml 2.00ml 3.33ml 10.00ml 33.33ml

p=1.017.




ДСН

Додецилсульфат натрію, лаурилсульфат натрію; [CH₃(CH₂)₁₀CH₂SO₄]Na; Mw=288.4g/M; (зберігати при NT).

Конц. Stock %(w/w) 100 ml 250 ml 300 ml 400 ml ДСН 10%(w/v) твердий 9.82 10g 25g 30g 40g H2O   mQ 90.18 91.8 ml 229.5 ml 275.4 ml 367.2 ml

p = 1.018

зважувати у витяжній шафі (краще одягти маску);

необхідно нагріти до 60-80^oC для полегшення розчинності. Перевірити рН. Якщо рН суттєво відрізняється від нейтрального (~7.2-7.5) - довести додаванням розведеного лугу або кислоти.





Органічні розчинники

Фенол

C₆H₅OH; Mw=94.1g/M
p=1.054, t_m= 43, t_b= 182, pKa=10.0
розчинність: 6.8¹⁶H₂O, необмежена ⁶⁶H₂O; необмежена EtOH

Приготування "кислого" та "нейтрального" фенолу.

a) з дистиляту:

1. дистилювати фенол під шаром H₂O;
2. додати воду до об'єму близько 1/10 фенольної фази;
3. додати 8-гідроксихінолін до 0,1% (відносно фенольної фази) та bMeEtOH (2-меркаптоетанол) до 0,2% (відносно H₂O = 0.02% відносно фенольної фази);

---- на цьому кроці ви отримали "кислий фенол". Зберігати при -20^oC (~1 рік); ----

4. додати до фенолу приблизно рівний об'єм 0.2 M Tris-основи, перемішувати впродовж ~0.5-1год;
5. злити водну фазу;
6. + 0.1V 0.1M Tris-Cl, pH 8.0
7. 0.2% bMeEtOH
8. перемішувати впродовж ~0.5-1год;
9. зберігати при 4^oC (у темному місці) ~кілька місяців.

b) з якісного комерційного препарату:

1. наситити фенол водою (додати 1/5 об'єму);
2. потім продовжувати відповідно до (а) з п.2

______________
* Для екстракції РНК краще наситити (просто додати) "кислий фенол" наступним буфером: (зберігати при 4^oC):

Конц. Stock 100ml AcONa, pH 5.1 50mM 3M 1.67ml EDTA 10mM 0.5M 2.0ml H2O   mQ 96.0ml

перевірити рН та довести додаванням розведеної (1:100) оцтової кислоти при необхідності.

у "Mitchell Group Methods" було вміщено примітку, що кислий фенол є набагато більш стабільним за нейтральний. Вони рекомендують готувати нейтральний фенол у малих об'ємах лише на кілька тижнів.




EtOH

CH₃CH₂OH; Mw=46.1g/M;

p (w/w) % (v/v) %   p (w/w) % (v/v) %   p (w/w) % (v/v) % 0.7892 100.00     0.83 85.4     0.89 60.5   0.79 99.7     0.84 81.4     0.90 56.12   0.80 96.5     0.85 77.3     0.91 51.71   0.8042 95.00 96.80   0.86 73.2     0.92 47.2   0.81 92.9     0.8678 70.02 76.96   0.93 42.50   0.8114 92.42 95.01   0.87 69.0     0.94 37.6   0.8178 90.05 93.31   0.88 64.8           0.82 89.2     0.8855 62.40 70.01

дуже гігроскопічний (зберігати при нормальній температурі у щільно закоркованій пляшці); t_melt.=-117.3^oC; t_boil.=78.5^oC.




Конц. Stock 300ml EtOH 70% 96% 190g H2O   mQ 70ml





Приготування 100% EtOH

1. висушити CuSO₄ (при 65^oC, 1-2 дні) до практично білого кольору;
2. змішати близько 1/4 об'єму CuSO₄ з 3/4 об'єму 96%EtOH;
3. інтенсивно перемішувати;
4. залишити на 1-2 дні (CuSO₄ "вбере в себе" воду з етанолу).

тест на "100%" етанол: додати краплину етанолу до ксилену. У разі 100% етанолу не повинно з'явитися туману.

"Практична Молекулярна Біологія" http://molbiol.ru/ukr
e-mail: editor@molbiol.ru